甲磺酸伊马替尼对顺铂耐药卵巢癌细胞COC1增殖与诱导凋亡的作用

目的:探讨甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)对顺铂(DDP)耐药卵巢癌细胞COC1增殖的抑制作用和对细胞诱导的凋亡作用。方法:采用MTT法检测甲磺酸伊马替尼对细胞增殖的影响。采用HE染色法电子显微镜观察细胞的凋亡。采用双染色流式细胞术检测甲磺酸伊马替尼作用于COC1/DDP发生的细胞凋亡。结果:甲磺酸伊马替尼对COC1细胞增殖表现出浓度依赖性的抑制作用,并显著提高其对DDP的敏感性(P<0.05);甲磺酸伊马替尼和DDP联合用药对COC1细胞均表现为明显的诱导凋亡特征,与单独应用DDP,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:甲磺酸伊马替尼能够抑制DDP耐药卵巢癌细胞COC1的增殖与凋亡,并显著增强其对DDP的敏感性。     

Genistein对COC1/DDP细胞增殖、凋亡和顺铂敏感性的影响

目的:探讨Genistein对顺铂耐药卵巢癌细胞COC1/DDP增殖、凋亡和顺铂敏感性的影响。方法:用MTT法检测Genistein单用及与顺铂合用对COC1/DDP细胞增殖的影响;流式细胞仪分析Genistein及Genistein联合顺铂对细胞周期和凋亡的影响及线粒体膜电位的变化;比色法检测Caspase-3活性变化。结果:Genistein对COC1/DDP细胞增殖表现出浓度依赖性的抑制作用,并显著提高其对顺铂的敏感性(P<0.05);0.625~5μg/m l顺铂与2.5~10μg/m lGenistein合用基本表现为协同作用。5μg/m l以上浓度Genistein可诱导一定程度的早期凋亡,当顺铂与Genistein合用时,两种药物在诱导COC1/DDP早期凋亡方面呈现显著的协同效应。与对照组相比,Genistein能降低细胞膜电位,增加caspase-3活性。结论:Genistein能抑制COC1/DDP细胞增殖,并显著增强其对顺铂的敏感性。     

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。     

β-连环素对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨信号分子β连环素(β-catenin)在多个卵巢癌耐药细胞系中的表达及其对顺铂耐药性的影响。方法:首先在2个卵巢癌耐药细胞系(C13K,SKOV-3),2个卵巢癌敏感细胞系(OV2008,A2780),A2780顺铂敏感株、A2780-cis顺铂耐药株,COC10顺铂敏感株、COC1-cis顺铂耐药株中检测β-catenin蛋白的水平。通过小干扰RNA(si RNA)介导的RNA干扰技术靶向沉默细胞中β-catenin的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证β-catenin基因沉默效果。台盼蓝染色方法分析β-catenin基因沉默对细胞化疗药物顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测顺铂处理后β-catenin基因沉默细胞的凋亡率。Western blotting筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:β-catenin在2个卵巢癌耐药细胞系C13K,SKOV-3中蛋白水平较敏感细胞系明显上调。与亲本A2780和COC10细胞相比,在耐药株A2780-cis和COC1-cis中表达水平也明显增高。β-catenin si RNA能显著抑制细胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后,卵巢癌耐药细胞C13K,SKOV-3对顺铂敏感性显著增高;流式细胞术进一步分析发现β-catenin基因沉默可以促进顺铂介导的卵巢癌耐药细胞的细胞凋亡。Western blotting发现β-catenin基因沉默后,顺铂处理可以显著上调促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。结论:β-catenin在卵巢癌耐药细胞系表达明显增高,β-catenin沉默可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,并同时促进了顺铂介导的细胞凋亡。     

三氧化二砷对卵巢癌细胞的生长及化疗敏感性的影响

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人卵巢癌COC1细胞顺铂(cDDP)化疗敏感性的影响,As2O3与cDDP联合作用的效应以及As2O3对COC1细胞的生长抑制效应及机制。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度As2O3、cDDP作用72h对卵巢癌细胞生长的抑制作用,As2O3对顺铂化疗敏感性的影响及两药联合作用的效应。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western blot)分别检测PIK3CA mRNA和AKT、ERK、MMP-2蛋白表达的变化。结果:单独应用As2O3或cDDP和联合用药时卵巢癌COC1细胞生长均受到抑制,并呈浓度依赖关系,联合用药组抑制率明显高于单独用药组(P<0.05);0.08~0.15μmol/L As2O3无明显细胞毒性,不能提高COC1细胞对顺铂的敏感性。各浓度(1、3、8、16μmol/L)As2O3作用24h可以下调AKT、MMP-2蛋白水平(P<0.05),并呈浓度依赖效应,但对ERK蛋白的表达无显著影响。0.5、1、2、4μmol/L As2O3作用4h,PIK3CA mRNA表达分别降低45.03%、53.05%、61.67%和72.91%(P<0.05)。结论:As2O3抑制COC1细胞增殖具有浓度依赖性,与顺铂联用有相加效应,可能与As2O3下调PIK3CA mRNA、AKT、MMP-2蛋白水平等有关。     

促性腺激素释放激素类似物对耐药卵巢癌细胞血管形成的抑制作用

目的:研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物曲普瑞林(triptorelin)联合顺铂(c DDP)对卵巢癌顺铂耐药细胞血管生成的抑制效果,并探讨其作用机制。方法:体外筛建卵巢癌OVCAR-3细胞系的顺铂耐药模型OVCAR-3/c DDP,并建立其裸鼠皮下荷瘤模型。实验分为对照组(NS组)、曲普瑞林组、顺铂组、曲普瑞林+顺铂组。采用实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot法分别检测VEGF mRNA和蛋白表达。采用鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测用药后对荷瘤组织血管生成的影响。结果:曲普瑞林+顺铂组的VEGF mRNA和蛋白表达显著低于曲普瑞林组、顺铂组及NS组(P0.05)。鸡胚尿囊膜实验结果显示,曲普瑞林和顺铂单独用药均能抑制耐药荷瘤组织的血管形成,抑制率分别为20.76%和16.66%;两药联合作用后抑制作用更显著,抑制率达36.50%。结论:GnRH类似物曲普瑞林联合顺铂可明显抑制顺铂耐药卵巢癌细胞的血管生成,其机制可能与下调VEGF表达有关。     

雷公藤内酯醇对耐顺铂人卵巢癌细胞株(COC1/DDP)体外活性影响机制的初步探讨

目的:通过研究雷公藤内酯醇(TP)对COC1/DDP体外活性的影响,初步探讨雷公藤内酯醇促进COC1/DDP细胞凋亡的机制,为TP成为治疗晚期或耐顺铂卵巢癌药物提供实验依据。方法:采用MTT法检测顺铂(DDP)、TP及两者联用对COC1/DDP的生长抑制作用;用透射电镜观察TP作用24h后细胞超微结构的变化;采用流式细胞术分析不同浓度TP对COC1/DDP细胞周期和细胞凋亡的影响;用DNA电泳分析用药后细胞基因组DNA断裂状况;以免疫组化分析TP对Caspase-7蛋白表达的影响。结果:DDP在24h、48h和72h三个时间段对COC1/DDP细胞的半数抑制量(50%concentration of inhibi-tion,IC50)分别为5.567μg/ml、2.866μg/ml和1.161μg/ml,其对COC1/DDP细胞增殖表现出浓度-时间依赖性的抑制作用(P<0.05);TP可抑制COC1/DDP细胞增殖,其抑制率呈浓度-时间依赖性(P<0.05);TP作用细胞24h后,电镜下可见凋亡小体形成;流式细胞术分析表明,各浓度TP组G1期细胞明显升高,细胞凋亡率呈浓度依赖性(P<0.05);DNA电泳分析可见细胞凋亡特有的DNA断裂形成的"梯形"条带;免疫组化表明Caspase-7参与了TP诱导COC1/DDP细胞凋亡过程。结论:TP对COC1/DDP具有明显的杀伤和促凋亡作用,凋亡机制与Caspase-7蛋白表达上调有关。     

L型氨基酸转运蛋白抑制剂BCH联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨L型氨基酸转运蛋白抑制剂2-氨基双环-(2,2,1)-庚烷-2-羧酸(BCH)单用及联用顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞生长的影响及其可能的分子机制。方法:人卵巢癌SKOV3细胞经不同浓度的BCH及BCH联合顺铂处理后,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性;Western blot检测BCH对mTOR通路的影响。结果:单用BCH可显著抑制SKOV3细胞增殖,并呈现一定的时间-剂量依赖性。联用顺铂较之单独用药组,细胞活性明显降低(P<0.01),且BCH在顺铂之后应用时抑制作用更为明显(P<0.05)。Western blot显示BCH可抑制mTOR、p70 S6K和4E-BP1磷酸化,阻断mTOR通路。结论:L型氨基酸转运蛋白抑制剂BCH单用及联用顺铂均可显著抑制人卵巢癌SK-OV3细胞增殖,且BCH在顺铂之后应用抑制作用更明显,呈协同作用。     

抑癌基因SPARCL1低表达对卵巢癌耐药和临床预后的影响

目的:探讨SPARCL1表达对卵巢癌顺铂耐药的影响,阐明SPARCL1表达与耐药及预后的相关性。方法:RT-qPCR和Western blot法检测卵巢癌细胞中SPARCL1表达,免疫组化法(IHC)检测卵巢癌组织中SPARCL1表达,Kaplan-Meier生存曲线分析基因表达与无疾病生存期(DFS)和总生存期(OS)的关系。慢病毒转染过表达或干扰基因在顺铂耐药细胞SKOV3/DDP中的表达,CCK-8法检测细胞增殖并计算IC_(50)。转录组测序研究SPARCL1表达对卵巢癌细胞分子水平的影响。结果:与卵巢癌敏感组织相比,SPARCL1蛋白在耐药组织中显著低表达(P=0.001),且该蛋白低表达能预测卵巢癌不良DFS(P=0.001)和OS(P=0.021)。SPARCL1在顺铂耐药细胞SKOV3/DDP中显著下调表达,其过表达能减缓耐药细胞增殖速度并提高对顺铂的敏感性,而干扰其表达则能加快细胞增殖并降低细胞对顺铂的敏感性。转录组测序结果发现,SPARCL1过表达可能影响p53及细胞黏附分子等经典卵巢癌耐药调控通路。结论:SPARCL1低表达促进耐药且与不良OS和DFS显著相关,有望作为卵巢癌治疗靶标和潜在预后标记物应用于临床。     

TOFA抑制上皮性卵巢癌细胞活性的体外实验研究

目的:探讨乙酰辅酶A羧化酶抑制剂TOFA对卵巢癌COC1细胞增殖能力的抑制作用及其机制。方法:采用细胞增殖/毒性检测试剂(CCK-8)检测不同浓度TOFA作用24、48、72h对卵巢癌细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测COC1的细胞周期变化情况,免疫印迹技术(Western blot)检测COC1细胞磷酸化AKT、ERK蛋白表达的变化。结果:不同浓度(1、5、10、20、50μg/ml)TOFA分别作用24、48、72h后,对卵巢癌细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖。5、10、20、50μg/ml TOFA处理48h后实验组和对照组相比,阻滞于G0/G1期的细胞数明显增加(P<0.05)。10μg/ml TOFA作用后,可上调磷酸化AKT蛋白表达,60min后磷酸化ERK蛋白表达抑制率为47%(P>0.05)。结论:TOFA对卵巢癌细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制磷酸化ERK表达,TOFA发挥作用的机制可能与MAPK/ERK信号转导通路相关。     

人端粒酶催化亚基基因反义寡核苷酸对卵巢癌细胞端粒酶活性及细胞生长的影响

目的：探讨人端粒酶催化亚基（hEST2)基因反义寡核苷酸（AODN）对卵巢 癌细胞系SKOV3、COC1细胞端粒酶活性及细胞生长的影响。方法：分别采用逆转录聚酶链反应技术、端粒重复扩增法、四甲基偶氮唑蓝法、 绘制细胞生长曲线的方法检测hEST2基因AODN转染前后SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA表达、端粒酶活性的变化,以及对细胞增殖能力及细胞生长的影响。结果：hEST2基因AODN能够下调SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA的表达,降低端粒酶活性,抑制细胞的生长,作用具有明显的时效性。以浓度为30μmol／L的AODN治疗48h的作用最显著,SKOVE、COC1细胞hEST2 mRNA的表达分别下降54．6％、44．6％,对两 株细胞的端粒酶活性抑制率分别达到47．9％、42．7％,与相同浓度的随机寡核苷酸（RODN）、正义寡核苷酸（SODN） 相比,差异有显著性（P＜0．05)。结论：hEST2基因的反义治疗能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力,该基因有望成为卵巢治疗的新方向。     

全反式维甲酸与顺铂联合在体外对卵巢癌细胞株3AO增殖、分化、凋亡的影响及其机制的探讨

目的 观察全反式维甲酸（ATRA）和顺铂（CDDP）在体外对人卵巢癌细胞株3AO的增殖、分化和凋亡的影响，探讨全反式维甲酸提高3AO细胞株对顺铂化疗敏感性的机制。方法 ATRA，CDDP以及两药联合分别处理卵巢癌3AO细胞株，MTT法检测细胞存活率，瑞氏染色后高倍镜下计数凋亡细胞数，细胞免疫化学测定bcl-2，p53的表达。显微镜下观察细胞形态变化。结果 细胞存活率在联用组中随ATRA剂量的增加而下降，且低于同剂量单用组（P〈0．01）；细胞凋亡率在联用组中随ATRA剂量的增加而增加，且高于同剂量单用组（P〈0．01）；bcl-2在联用组中随ATRA剂量的增加而下降，p53在联用组中随ATRA剂量的增加而增加。细胞形态随ATRA剂量的增加而趋向下成熟细胞。结论 全反式维甲酸能抑制卵巢癌细胞株3AO的增殖，诱导其分化，提高其对顺铂促凋亡效应的敏感性。其作用机制可能与bcl-2的表达下降有关，p53作用尚不清楚。     

Apoptosis induced by cisplatin and verapamil or SDZ PSC 833 in human ovarian cell lines]

OBJECTIVE: To study the pharmaceutical mechanisms of cisplatin (DDP), verapamil (VP) and SDZ PSC833, and the mechanism of developing acquired drug resistance. METHODS: Two ovarian carcinoma cell lines--one sensitive (COC(1)) and the other resistant (COC(1)/DDP) to cisplatin were used in this study. The cell viability was measured by trypan blue dye exclusion assay. The apoptotic cells were observed and distinguished by light and electron microscopy, and comet assay. Flow cytometry was used to measure the cell cycle. Six groups were set up according to drug(s) delivered: DDP, VP, SDZ PSC833, DDP and VP, DDP and SDZ PSC833, and control group. RESULTS: (1) VP or SDZ PSC833 enhanced cytotoxicity of DDP (q > 1, P < 0.01). (2) The most prominent effect of DDP on cell cycle kinetics was a slowdown in S-phase transit during which cells undergo apoptosis (P < 0.05). (3) COC(1) and COC(1)/DDP cells had different rates of apoptosis when DDP added. SDZ PSC833 enhanced apoptosis of COC(1)/DDP cells induced by DDP. CONCLUSIONS: VP and SDZ PSC833 increase sensitivity of the cell lines to DDP. SDZ PSC833 enhances apoptosis induced by DDP. Induction of apoptosis is one of the pharmaceutical mechanisms of DDP, and acquired drug resistance is associated with resistance to apoptosis. The most prominent effect of DDP on cell cycle kinetics is a slowdown in S-phase transit and apoptotic cells are at S-phase.     

顺铂耐药卵巢癌细胞鼠肾包膜下动物模型的建立及其临床意义

目的 :建立顺铂耐药卵巢癌细胞鼠肾包膜下动物模型 ,探讨其临床意义。方法 :采取肾包膜下纤维蛋白细胞凝块移植法 ,用环磷酰胺免疫抑制小鼠建立顺铂耐药卵巢癌模型。结果 :移植后 7d肿瘤体积明显增大 ,顺铂耐受细胞组与非耐受细胞组体积无明显差异 (P >0 .0 5) ;移植后细胞形态学特征无改变 ;在用顺铂治疗后 ,耐药细胞组肿瘤体积较非耐药细胞组体积大 (P <0 .0 5)。结论 :该动物模型可作为短期体内实验模型 ,能保持细胞的耐药性     

神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的体外研究

目的:探讨神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的作用及机制,为筛选有效的卵巢癌顺铂耐药逆转剂提供实验依据。方法:本研究采用MTT法测定不同剂量的C6-神经酰胺(Ceramide C6)(5、10、20、40μmol/L)对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用,以RT-PCR、Westernblot法检测Ceramide C6对肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达的影响,应用流式细胞技术观察Ceramide C6对肿瘤细胞凋亡的影响。结果:Ceramide C6对SKOV3、SKOV3/DDP细胞生长有抑制作用,与DDP联合应用时可增强DDP敏感性。SKOV3细胞中,与对照组相比,不同浓度Ceramide C6使顺铂敏感性分别增加了7.23%、20.14%、45.02%、57.75%。SKOV3/DDP细胞中,顺铂敏感性分别增加了23.08%、24.57%、45.86%、65.78%。随Ceramide C6浓度增加,SKOV3和SKOV3/DDP细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表达逐渐减低,差异有统计学意义(F=41.780,P=0.000;F=223.258,P=0.000;F=98.306,P=0.000;F=224.687,P=0.000)。Ceramide C6可增加SKOV3、SKOV3/DDP细胞凋亡率,差异有统计学意义(F=135.625,P=0.000;F=224.906,P=0.000)。结论:神经酰胺可能通过抑制肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡途径,增强顺铂对卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞体外生长的抑制作用,在一定程度上逆转了卵巢癌顺铂耐药。     

卵巢癌血管内皮生长因子过度表达及肿瘤浸润转移机制的探讨

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)过度表达在卵巢癌浸润转移中的作用及可能机制。方法　脂质体介导VEGFcDNA转染卵巢癌细胞系CAOV3、COC1 ,并经逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术、蛋白印迹 (Westernblot)法检测转染VEGFcDNA前后卵巢癌细胞中VEGF、明胶酶A(MMP 2 )mRNA及其蛋白表达水平 ;Boyden小室体外侵袭实验比较VEGFcDNA转染前后卵巢癌细胞穿透人工重组基底膜能力的变化。结果　VEGFcDNA转染后卵巢癌细胞系CAOV3、COC1细胞中VEGFmRNA表达水平分别为 0 98± 0 0 5和 0 87± 0 0 6 ,MMP 2mRNA表达水平分别为 0 95± 0 0 3和 0 82±0 0 2 ,均较转染前 (分别为 0 84± 0 0 3和 0 62± 0 0 4 ,0 71± 0 0 2和 0 61± 0 0 1 )明显增加 (P <0 0 5) ;VEGF、MMP 2蛋白表达水平也呈相同变化趋势 (P <0 0 5) ;VEGFcDNA转染后的CAOV3、COC1细胞的穿透人工重组基底膜的能力分别为 (42 5± 4 1 ) % ,(2 6 8± 2 4) % ,较对照组 [(2 4 7± 1 9) % ,(8 6±1 1 ) % ]明显增加 (P <0 0 5)。结论　VEGF促进卵巢癌浸润、转移的机制可能与诱导MMP 2合成及分泌有关。