ETS1在多巴胺能神经元发育中的作用

【立论依据】 帕金森病是第二大神经系统退行性病变,主要多发于60岁以上的老年人。其基本病理改变是特异性多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死,数量减少,致使多巴胺释放减少,但具体机制不明。从多巴胺能神经元发育的角度或许能解释多巴胺释放减少的分子机制。多巴胺神经元发育的各个阶段都有转录因子基因参与调控, 如SHH、FGF、Nurr1、Pitx3、Mash1 等。这些因子决定了多巴胺能神经元发育的命运并控制了一些重要的发育过程。作为转录因子,ETS1表达于发育中的脑组织。在前期研究发现ETS1影响胚胎神经发育的基础上,过表达ETS1抑制酪氨酸羟化酶(TH)的表达。但ETS1在多巴胺能神经元发育的哪一阶段发挥作用,如何发挥作用均未阐明。 【设计思路】 利用非洲爪蟾作为模式动物,通过过表达或封闭ETS1表达,检测在多巴胺能神经元发育的不同阶段标志基因的表达,探讨ETS1影响多巴胺能神经元发育的阶段;进而寻找ETS1的下游靶基因。 【实验内容】 选择分裂良好的非洲爪蟾胚胎,利用显微注射方法注射ETS1 mRNA或反义寡核苷酸,实现ETS1的过表达或基因封闭,在神经发育的不同阶段收集胚胎,提取RNA或蛋白质,利用定量RT-PCR、整胚原位杂交及蛋白质印迹方法检测标志基因的表达改变。之后,通过萤光素酶报告基因方法检测ETS1对其靶基因的转录调控。 【材料】 非洲爪蟾胚胎,ETS1 mRNA、反义寡核苷酸,原位杂交用探针及其他试剂,RT-PCR、蛋白质印迹试剂,报告基因检测系统,其他常规试剂。 【可行性】 本课题建立在前期预实验的基础上,研究方向明确;非洲爪蟾胚胎体积大,易于进行显微注射;胚胎在体外发育,便于随时观察表型。 【创新性】 发现新的调节多巴胺能神经元发育的转录因子ETS1及其作用机制,为探讨帕金森病的发生机理提供新的线索。     

多巴胺能神经元与帕金森病

中脑多巴胺能神经元是哺乳动物中枢神经系统多巴胺的主要来源。多巴胺能神经元的缺失与帕金森病的发病密切相关。本文主要综述了中脑多巴胺系统的组成以及多巴胺能神经元在帕金森病中的作用。     

黄连素抑制促炎症因子生成保护多巴胺能神经元

目的探讨黄连素对炎症介导的多巴胺能神经元损伤的影响。方法于中脑原代神经元-胶质细胞培养体系中,应用脂多糖建立多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,黄连素（10、20μg/ml和40μg/ml）与脂多糖（1-100 ng/ml）同时处理该培养体系。免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测促炎症因子,包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）（ELISA法）、一氧化氮（NO）（Griess反应）和超氧化物（细胞色素c还原法）的变化。结果黄连素（10、20μg/ml和40μg/ml）对脂多糖（1-100 ng/ml）诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具显著的保护作用,且呈剂量依赖性;黄连素也显著降低促炎症因子TNF-α、IL-1β、NO和超氧化物的生成。结论黄连素抑制促炎症因子生成,保护多巴胺能神经元。     

”微岛“原代培养新生大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元

目的 探讨“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的方法,研究不同培养液维持多巴胺能神经元存活和生长的效果,及多巴胺能神经元与其他神经元在“微岛”上的共培养,为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。方法 利用神经细胞不能粘附于琼脂糖上生长的原理,先用琼脂糖制成非粘附性底物,再将胶原喷洒其上形成粘附性的“岛”样底物,接种神经胶质细胞形成微岛样饲养层后,将大鼠中脑腹侧神经元接种于“微岛”上生长。结果 中脑腹侧多巴胺能神经元可在“微岛”上生长,即使单个神经元也生长良好。在共培养时,能与其他神经元形成突触联系。结论 确定适于“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的培养条件,该培养法可为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。     

米诺环素抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元

目的 探讨米诺环素对炎症介导的中脑多巴胺能神经元损伤的影响.方法 应用脂多糖处理中脑原代神经元/胶质细胞培养体系建立SD大鼠多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,于脂多糖处理该培养体系前或后加入米诺环素,免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(ELISA法)、白介素-1β(IL-1β)(ELISA法)、一氧化氮(NO)(Griess法)和超氧阴离子(细胞色素C还原法)等促炎因子的变化.结果 米诺环素(2～10 μmol/L)前处理对脂多糖(J～ 100 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具有显著的保护作用.呈剂量依赖性;米诺环素( 10μmol/L)后处理对脂多糖(10 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤也具有显著的保护作用;米诺环素显著降低促炎因子TNF-α、IL-1β、NO和超氧阴离子的生成.结论 米诺环素在脂多糖处理的中脑神经元/胶质细胞培养体系中可能通过抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元.     

人类中脑神经祖细胞的体外扩增及诱导分化

目的：探讨人类中脑祖细胞体外分离、培养及向多巴胺能神经元诱导分化的方法。方法：利用neurosphere法，在低氧分压的情况下建立中脑祖细胞克隆，并用纹状体培养上清对其进行诱导分化，观察TH阳性神经元的分化比率及成熟度。结果：中脑来源的神经祖细胞克隆，能以neurosphere形式生长，低氧分压对其克隆生长具有促进作用；纹状体培养上清可增加TH阳性神经元的分化比率，并能使TH阳性细胞具有更成熟的多巴胺能神经元的形态特征。结论：低氧分压更适于中脑神经祖细胞的体外扩增，纹状体培养上清对中脑祖细胞向多巴胺能神经元的分化及成熟具有促进作用。     

白介素-10抑制促炎症因子生成保护多巴胺能神经元

目的 探讨白介素-10(IL-10)对炎症介导的多巴胺能神经元损伤的影响.方法 于中脑原代神经元-胶质培养体系中,应用脂多糖建立多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,IL-10(10～100 ng/mL)与脂多糖(1～100 ng/mL)同时处理该培养体系.免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测促炎症因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)(ELISA法)、一氧化氮(NO)(Griess反应)和超氧化物(细胞色素C还原法)的变化.结果 IL-10(10～100 ng/mL)对脂多糖(1～100 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具显著的保护作用,且呈剂量依赖性;IL-10也显著降低促炎症因子TNF-α、IL-1β、NO和超氧化物的生成.结论 IL-10抑制促炎症因子生成,保护多巴胺能神经元.     

白介素-10抑制促炎症因子生成保护多巴胺能神经元

目的探讨白介素-10(IL-10)对炎症介导的多巴胺能神经元损伤的影响。方法于中脑原代神经元-胶质培养体系中,应用脂多糖建立多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,IL-10(10~100 ng/mL)与脂多糖(1~100 ng/mL)同时处理该培养体系。免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测促炎症因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)(ELISA法)、一氧化氮(NO)(G riess反应)和超氧化物(细胞色素C还原法)的变化。结果IL-10(10~100 ng/mL)对脂多糖(1~100 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具显著的保护作用,且呈剂量依赖性;IL-10也显著降低促炎症因子TNFα-、IL-1β、NO和超氧化物的生成。结论IL-10抑制促炎症因子生成,保护多巴胺能神经元。     

MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性的影响

目的　探讨 1 甲基 4 苯基吡啶 (MPP+ )对体外培养的中脑多巴胺能神经元的影响。方法　将不同浓度的MPP+ 加入体外培养的中脑多巴胺能神经元培养液中 ,分别测定 [3H]多巴胺和 [3H]胆碱摄取能力及细胞内的多巴胺含量 ,并进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色。结果　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元的 [3H]多巴胺摄取力有明显的抑制作用 (P <0 0 5 ) ;但对[3H]胆碱摄取力无抑制作用 (P >0 0 5 ) ;这种抑制作用在未抑制胶质细胞组明显强于抑制胶质细胞组 (P <0 0 5 ) ;加用MPP+ 后中脑多巴胺能神经元细胞内的多巴胺含量明显减少 (P <0 0 5 ) ,TH阳性细胞明显减少 (P <0 0 5 )。结论　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性有明显的抑制作用     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养多巴胺能神经元营养作用

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对体外培养的中脑多巴胺能神经元的作用。方法：在培养孕14－16d大鼠胚胎黑质神经元中加入碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)，不同时间对培养细胞进行观察并计数存活的黑质细胞总数及长神经突起细胞总数。结果：培养1周后bFGF可促进多巴胺能神经元的存活和生长。结论：bFGF对体外培养的多巴胺能神经元有营养作用。     

成年与老年大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元形态学研究

目的研究大鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元随年龄老化的形态学变化规律，探讨其退行性变的形态学依据。方法SD大鼠16只，雄性，分为成年组（4-5月龄）和老年组（≥18月龄）。取中脑黑质，常规制片，连续冠状切片，分别进行焦油紫染色和TH免疫组化染色，用图像分析仪分别对Nissl染色细胞、TH免疫组化染色阳性神经元进行计数，透射电镜观察神经元的超微结构变化。结果老年大鼠中脑黑质神经元数量减少（P〈0．05），TH阳性神经元也同时减少（P〈0．05），且在超微结构上老年大鼠多巴胺能神经元出现内质网扩张及多量脂褐素形成。结论老年黑质退行性病变可能与中脑黑质致密部多巴胺能神经元数量减少有关。     

CD200-CD200R介导静止的MG受损对中脑多巴胺能神经的退行性变的影响研究

目的 探讨CD200-CD200受体(CD200 receptor,CD200R)介导的静止的小胶质细胞(microglia,MG)受损对中脑多巴胺能神经元退行性变的影响以及相关的损害因素。方法 用CD200R的抑制性抗体(anti-CD200R blocking antibody,ACDR)处理添加了铁(Ferrum,Fe)的中脑神经元培养物,并同时设立磷酸盐生理盐水缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)对照组,检测培养物中多巴胺(dopamine,DA)的摄取含量,过氧化物的生成。采用SAS6.12软件进行统计分析,以P<0.05为差异有统计意义。结果 与对照组比较ACDR处理组DA的摄取含量明显减少,过氧化物的生成明显增加,差别有统计学意义(P<0.05)。结论 多巴胺能神经元的神经毒性由Fe在培养的中脑神经元中诱导产生,MG通过ACDR与Fe的结合来表达对多巴胺能神经元的毒性,多巴胺能神经元的神经毒性取决于DA的摄取,过氧化物的生成对多巴胺能神经元的神经毒性起关键作用,ACDR显著提高了多巴胺能神经元对神经毒性的易感性。     

中脑多巴胺能神经元自身受体DRD2的功能与调控

多巴胺受体家族共有5个成员,在运动、奖赏、情感、记忆等多种神经功能中发挥重要的作用。尽管大部分多巴胺受体分布在非多巴胺能神经元上,还有一部多巴胺受体分布于多巴胺能神经元中,这部分多巴胺受体被称为多巴胺自身受体,其中多巴胺受体D2(dopamine receptor D2,DRD2)是最重要的多巴胺自身受体。本文将对DRD2自身受体的结构、功能、调节机制进行综述,以期对多巴胺神经系统的功能和作用机制加深理解。     

百草枯和氧桥氯甲桥萘对离体大鼠中脑多巴胺神经元的损害

目的建立大鼠中脑多巴胺神经元的培养体系,判断百草枯(Paraquat)和氧桥氯甲桥萘(Dieldrin)能否对培养的大鼠中脑多巴胺神经元产生选择性损害。方法将0.001～100μmol/L浓度的Paraquat、Dieldrin加入到原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元中,计数存活的多巴胺神经元和非多巴胺神经元。结果Paraquat对大鼠中脑多巴胺神经元无选择性损害。1μmol/LDieldrin能选择性损害大鼠中脑多巴胺神经元。结论Dieldrin可能是致帕金森病(PD)的神经毒物,它与PD病因之间的联系值得进一步研究。     

JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活致多巴胺能神经元变性

目的 探讨JAK2-STAT3途径与凝血酶诱导多巴胺能神经元变性作用的关系.方法 20 U/ml凝血酶或AG490(10 μmol/L)预处理 凝血酶(20 U/ml)处理原代培养的小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系,用Western blot检测小胶质细胞P-JAK1、P-JAK2、JAK2、STAT3、P-STAT3的表达;免疫荧光观察多巴胺能神经元的变性;Western blot、RT-PCR及激光共聚焦观察iNOS的表达.结果 凝血酶处理小胶质细胞2 h后诱导JAK2、STAT3的磷酸化,2 h和4 h分别增加小胶质细胞iNOS的转录和表达,并且24 h诱导中脑培养体系多巴胺能神经元变性.而AG490预处理显著地减少对应凝血酶处理组小胶质细胞JAK2和STAT3的磷酸化,抑制iNOS的表达,并且缓解多巴胺能神经元的变性.结论 JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活,导致多巴胺能神经元变性.     

蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用

目的:观察蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用.方法:8周龄C57BL/6小鼠随机分组:磷酸盐缓冲液(PBS组)和lactacystin组,二种制剂分别单侧立体定向注射于中脑前脑束(Middle forebrain bundle);12周龄时灌注取脑分离纹状体,采用HPLC法测多巴胺、5-HT及代谢产物,取中脑观察黑质区多巴胺能神经元变性及包涵体样物质形成情况.结果:Lactacystin组同侧黑质区多巴胺细胞数减少51%,并可见泛素染色阳性的类包涵体样物质形成,同侧纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)浓度分别减少52%、46%和51%,而5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)浓度无改变.结论:蛋白酶体抑制剂可引起选择性黑质区多巴胺能神经元变性,并可能导致细胞内异常蛋白质聚集.     

大鼠黑质多巴胺能神经元的形态学发育

目的探讨大鼠黑质多巴胺(DA)能神经元的形态学发育和分布特征。方法行大鼠出生前后不同时期的脑黑质区段连续冠状石蜡切片，以酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色方法显示DA能神经元，焦油紫染色确定黑质区域，进行光镜观察以及细胞形态学指标的测量。结果胚胎(embryonicclay，E)第13天龄(E13)时，开始于中脑腹侧出现TH阳性(TH^ )细胞。至E16时，中脑腹侧这些细胞的数量和密度达到最大值，此后又逐渐下降，且于出生后早期这些TH^ 细胞的减少最为显著。至生后第14天龄(P14)时，中脑腹侧黑质区域TH^ 细胞的分布和密度不再明显改变，与成年期状态接近。胚胎期，TH^ 细胞多为圆形或椭圆形，随着胚胎发育，其突起逐渐伸长，分支也逐渐增多。出生后，TH^ 细胞逐渐表现为成熟神经元的形态特征。结论大鼠脑黑质DA能神经元的发育发生在个体出生前后，呈现先大量形成后又逐渐减少的过程，与此同时，其形态趋向成熟。至P14时，DA能神经元的分布和形态学发育基本成熟。     

乌头碱对胎鼠中脑多巴胺能神经元细胞的神经毒性作用

目的: 观察乌头碱对中脑多巴胺能神经元细胞的毒理作用,以了解和预防乌头碱及其衍生物产生的神经毒性作用。方法: 从孕14 d的小鼠中取出胎鼠中脑,并分离出多巴胺能神经元细胞,于5％CO2,37 ℃和100％湿度条件培养,培养第10天加入不同浓度的乌头碱(0.1,0.5,1,5,10,50 和100 μmol/L)作用48 h,于第12天免疫组化染色。选取神经元细胞数、神经元树突的长度和数量作为观察指标,并进行分析。结果: 乌头碱作用48 h后,不同浓度的乌头碱(0.5～100 μmol/L)对神经细胞生长均有明显的抑制作用,并表现出浓度依赖性神经毒性作用,高浓度乌头碱(10～100 μmol/L)的抑制强度高于低浓度组(0.5～5 μmol/L)。结论: 体外实验证实了乌头碱对中脑多巴胺能神经元有神经毒性作用。     

百草枯和氧桥氯甲桥萘对离体大鼠中脑多巴胺神经元的损害

目的 建立大鼠中脑多巴胺神经元的培养体系,判断百草枯（Ｐａｒａｑｕａｔ）和氧桥氯甲桥萘（Ｄｉｅｌｄｒｉｎ）能否对培养的大鼠中脑多巴胺神经元产生选择性损害。方法 将０．００１～１００ｕｍｏｌ／Ｌ浓度的Ｐａｒａｑｕａｔ、Ｄｉｅｌｄｒｉｎ加入到原代培养的大鼠中脑多巴胺神经元中,计数存活的多巴胺神经元和非多巴胺神经元。结果 Ｐａｒａｑｕａｔ对大鼠中脑多巴胺神经元无选择性性损害。１ｕｍｏｌ／Ｌ Ｄｉｅｌｄｒ     

SH-SY5Y细胞：帕金森病的体外多巴胺能神经元细胞模型

目的 综述SH-SY5Y细胞做为多巴胺能神经元细胞模型用于PD研究的潜力以及分化对这个细胞模型的影响。 结果 因为SH-SY5Y细胞具有许多多巴胺神经元的特征,包括表达多巴胺-β-羟化酶和酪氨酸羟化酶以及多巴胺转运体活性,已被广泛用做PD研究的多巴胺能神经元细胞模型。SH-SY5Y细胞在不同分化因子的作用下能够分化成有功能的成熟神经元表现型,同时分化使细胞停止增值并在整个实验中提供稳定的细胞数。然而不同的分化因子诱导不同的神经元表现型和生化改变。例如维甲酸诱导胆碱能神经元分化表现型并增加SH-SY5Y细胞对神经毒性和神经保护的耐受性,而维甲酸伴随佛波酯处理使SH-SY5Y细胞分化成多巴胺能神经元表现型并降低细胞的耐受性。某些分化因子还能改变SH-SY5Y细胞摄取MPP+的动力学,从而使细胞与体内和原代培养的中脑神经元具有更大的相似性。 结论 未分化和分化的SH-SY5Y细胞都被广泛的用做PD研究的多巴胺能细胞模型。某些分化因子使SH-SY5Y细胞在神经毒性、神经保护性和实验性PD研究中更具有潜力。