miR-301a促进人结肠癌细胞株HT29细胞侵袭与转移的机制

目的探讨miR-301a对结肠癌侵袭转移的影响及分子机制。方法实时荧光定量PCR检测40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平,探究结肠癌和miR-301a表达的关系。同时在人结肠癌细胞株HT29细胞过表达和干扰miR-301a,MTT法检测miR-301a对HT29细胞增殖的影响。蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR在分子水平上检测miR-301a表达对HT29细胞中侵袭相关分子的表达水平,探究miR-301a调控下的转化生长因子(TGF)-β/Smad4/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路对结肠癌侵袭转移的影响。结果实时荧光定量PCR结果显示40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平明显升高,且随着肿瘤分期分级的升高,其水平明显升高。MTT法检测发现过表达miR-301a的HT29细胞数量明显增加,而干扰miR-301a则细胞数目减少,表明miR-301a可促进结肠癌细胞的增殖。在分子水平上蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR检测结果显示miR-301a通过下调TGF-β和Smad-4的表达,促进MMP-9的表达,最终促进癌细胞的侵袭转移。结论 miR-301a通过下调TGF-β/Smad4信号通路,促进MMP-9的表达,最终促进结肠癌的侵袭转移。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默PIM2表达对结肠癌HT29细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响

目的探讨沉默PIM2表达对结肠癌HT29细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测人正常结肠上皮NCM460细胞和结肠癌HT29细胞中PIM2 mRNA和蛋白表达。以含PIM2 shRNA慢病毒载体感染HT29细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测感染效果,CCK-8法、Transwell实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡能力。结果与NCM460细胞相比,HT29细胞中PIM2 mRNA和蛋白表达明显升高(P0.05)。PIM2 shRNA慢病毒感染使HT29细胞中PIM2 mRNA和蛋白表达显著降低,显著抑制SGC7901细胞的增殖、侵袭和迁移并促进细胞凋亡(P0.05)。结论 PIM2在结肠癌HT29细胞中高表达,干扰其表达可抑制HT29细胞增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡。     

BALB/c与SCID裸小鼠高侵袭性人结肠癌肝转移模型的比较研究

目的建立裸小鼠人结肠癌肝转移的高侵袭性模型,比较BALB/c鼠与SCID鼠的人结肠癌肝转移模型,为侵袭性人结肠癌的研究寻找可靠的动物模型。方法首先将人结肠癌细胞株HT-29细胞悬液接种于免疫功能正常BALB/c鼠的脾包膜下,然后将其肝转移肿瘤组织通过原位移植方式分别种植于免疫缺陷BALB/c鼠和SCID鼠的盲肠浆膜下,而第三组直接将HT-29种植于结肠,最后观察三组的成瘤及死亡情况,以及淋巴转移率、肝转移率、肺转移率及腹腔种植率等。结果术后21 d观察,40只BALB/c鼠有38只成瘤,其余2只死亡;40只SCID鼠有33只成瘤,其余7只死亡;第三组40只(20只BALB/c鼠/20只SCID鼠)裸小鼠虽有29只成瘤,且仅1只死亡,但肝转移率(24.1%)较低,不适于建立高侵袭模型。前两组在原位移植瘤大小、转移和种植率上差异无统计学意义(P0.05),而两组成瘤率和死亡率的差异有统计学意义(P0.05)。结论将筛选出的人结肠癌肝转移组织用于建立模型,能有效模拟高侵袭性等生物学特性,再结合BALB/c鼠价格较低的优势,所以更适宜作为人结肠癌肝转移的可靠动物模型。     

胃癌细胞多药耐药相关基因的表达与其侵袭转移能力的相关性研究

目的探讨胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901的多药耐药相关基因的表达与其侵袭转移能力的关系。方法采用实时荧光定量PCR技术检测胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901的多药耐药相关基因(包括ABCB1、MMP2、CDH1、CD44)的mRNA表达水平。采用细胞划痕实验、Transwell迁徙实验评价两株胃癌细胞的侵袭转移能力,进而探讨胃癌细胞多药耐药相关基因的表达与侵袭转移能力的关系。结果荧光定量PCR实验发现胃癌细胞株BGC-823的ABCB1、CDH1、CD44基因表达较SGC-7901高,而MMP2基因的表达在SGC-7901中较高。细胞划痕实验及Transwell迁徙实验显示胃癌细胞株BGC-823的迁徙能力比SGC-7901强。结论胃癌细胞的多药耐药与侵袭转移有一定的关系,CD44的高表达在胃癌细胞的侵袭转移中可能起主要作用。     

E-cadherin对人大肠癌细胞株浸润行为的影响

目的研究上皮性钙调蛋白(E-cad)对人大肠癌细胞株浸润行为及Ⅳ型胶原酶(Ⅳcol)表达的影响。方法定量检测体外培养的人大肠癌细胞 E-cad 及Ⅳcol 的表达;应用人羊膜浸润模型,观察 E-cad 对大肠癌细胞浸润羊膜时的形态变化及细胞内Ⅳcol 表达的影响。结果低转移细胞株 HT29弱表达 E-cad,而高转移细胞株 LoVo几乎不表达 E-cad。两细胞株均表达Ⅳcol,高转移细胞株 LoVo 表达Ⅳcol 高于低转移株 HT29。瘤细胞用 E-cad单抗封闭后培养于羊膜上,两细胞株内Ⅳ型胶原酶表达明显增高,且以高转移株变化更为明显。结论 E-cad 可能通过细胞内信使传递作用影响细胞内Ⅳ型胶原酶的表达,从而对肿瘤影响浸润.     

用重组单纯疱疹病毒加强对弥漫性结肠癌肝转移的基因治疗特异性

单纯疱疹病毒(HSV)已开发用作基因转移至中枢神经系统的载体,其溶细胞毒性可用于癌肿的治疗。本研究评估HSV载体治疗弥漫性结肠癌肝转移灶的可行性。取人结肠癌细胞系HT29进行实验,用单克隆抗体MAS378AD203识别核糖核苷酸还原酶的M1亚单位,     

生存素反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞株凋亡的实验研究

背景:生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族的成员之一,在肿瘤组织和人类胚胎组织中有高水平表达,在分化成熟的组织中不表达或低水平表达。有研究显示,64.5%～85%的结肠癌组织中存在生存素基因表达,其表达与结肠癌患者的不良预后有关。目的:观察生存素反义寡核苷酸对结肠癌细胞株凋亡的影响。方法:通过基因工程技术构建生存素反义寡核苷酸质粒pcDNA3鄄sur鄄As,以脂质体转染的方法将质粒DNA转入结肠癌细胞株。应用逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测结肠癌细胞株中生存素mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪和碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡,比色测定检测caspase鄄3活性的变化。结果:SW1116、COLO205、HT鄄29和SW1417四株结肠癌细胞株中均有生存素mRNA和蛋白表达。瞬时转染生存素反义寡核苷酸后,4株结肠癌细胞株的细胞凋亡率均明显增加,并呈剂量依赖性(P<0.01);结肠癌细胞株SW1116在荧光显微镜下呈现典型的凋亡细胞形态,细胞中生存素蛋白表达水平明显降低,caspase鄄3活性显著增加(P<0.01)。结论:应用生存素反义寡核苷酸抑制生存素基因的表达能诱导结肠癌细胞株凋亡,以生存素为靶基因的治疗方案可能有助于结肠癌患者的治疗。     

TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建

目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-BsdV5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确;实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P<0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%,P<0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.     

E-cadherin对人大肠癌细胞株浸润行为的影响

目的 研究上皮性钙调蛋白(E-cad)对人大肠癌细胞株浸润行为及Ⅳ型胶原酶(Ⅳcol)表达的影响。方法 定量检测体外培养的人大肠癌细胞E-cad及Ⅳcol的表达；应用人羊膜漫润横型，观察E-cad对大肠癌细胞浸润羊膜时的形态变化及细胞内Ⅳcot表达的影响。结果 低转移细胞株HT29弱表达E-cad，而高转移细胞株LoVo几乎不表达E-cad。两细胞株均表达Ⅳcol，高转移细胞株LoVo表达Ⅳcol商子低转移株HT29。癌细胞用E-cad单抗封闭后培养于羊膜上，两细胞抹内Ⅳ型胶原酶表选明显增高，且以高转移株变化更为明显。结论 E-cad可能通过细胞内信使传递作用影响细胞内Ⅳ型胶原酶的表达，从而对肿瘤影响浸润。     

基于权重基因共表达分析的结肠癌肝转移相关基因挖掘与验证

目的挖掘结肠癌肝转移过程中的核心基因模块和分子靶点,并验证其对临床预后及结肠癌转移能力的影响。 方法基于GEO数据库结肠癌肝转移测序样本,利用权重基因共表达网络分析（WGCNA）技术筛选转移相关基因模块。利用MCODE软件进一步挖掘结肠癌肝转移相关核心子模块并分析其功能。基于TCGA数据库,进行子模块基因对结肠癌预后影响的大临床样本验证。分子生物学方法验证子模块基因对结肠癌细胞系HCT116迁移和侵袭能力的影响。 结果WGCNA分析筛选出5个基因模块,其中模块1与结肠癌肝转移关系密切。模块1共包含4个核心子模块,主要参与G蛋白偶联受体信号调节、表观遗传学调控、mRNA的剪接调节等功能。大临床样本验证发现子模块4中的FOXC1基因与结肠癌患者生存率密切相关。敲减FOXC1在HCT116细胞中的表达后,HCT116的迁移能力（t=3.123,P=0.035）和侵袭能力（t=2.936,P=0.043）受到显著抑制。 结论本研究筛选出的结肠癌肝转移相关子模块可能具有重要的促转移作用,子模块基因FOXC1与结肠癌患者较差的生存率相关并具有促结肠癌转移能力。     

五味子多糖对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制作用及其机制

目的探讨五味子多糖含药血清对人结肠癌细胞株HT29体外增殖的影响及作用机制。方法采用人结肠癌细胞株HT29作为研究对象,MTT法检测不同浓度的五味子多糖含药血清对细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和细胞核的改变;流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。结果五味子多糖含药血清对HT29细胞的增殖有抑制作用而且呈剂量和时间依赖性。五味子多糖含药血清作用72 h后,荧光显微镜可见凋亡细胞及凋亡小体;流式细胞仪检测凋亡。结论五味子多糖含药血清对HT29结肠癌细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡有关。     

EYA4基因在结直肠癌中的甲基化状态及其意义

背景：EYA4（eyes absent4）是一种非巯基蛋白酪氨酸磷酸酶,参与器官发育、细胞凋亡调控、先天性免疫、DNA损伤修复、血管生成等过程。目的：研究EYA4基因在结直肠癌中的甲基化状态及其意义。方法：选取2006年6月～2007年1月上海交通大学医学院附属仁济医院31例结直肠癌患者,采集其癌组织和相应癌旁非癌组织。以5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza—dC）处理人结肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480、SW1116。应用MSP技术检测结直肠癌组织、癌旁非癌组织、HT29、HCT116、SW480、SW1116细胞中EYA4基因启动子的甲基化状态。分析结直肠癌患者临床病理特征与EYA4基因甲基化关系。采用RT—PCR和蛋白质印迹法分别检测结肠癌细胞株中EYA4基因和蛋白的表达水平。结果：结直肠癌组织EYA4基因启动子甲基化率显著高于癌旁组织（77．4％对6．5％,P〈0．01）。EYA4基因和蛋白在启动子甲基化的HT29、HCT116、SW480细胞中不表达,在启动子非甲基化的SW1116细胞中显著表达。以5-Aza—dC处理后EYA4基因和蛋白在LIT29和SW480细胞中表达上调。结论：EYA4基因是结直肠癌发生的甲基化相关基因,有望成为结直肠癌的诊断标记物。     

DAC及TSA对结肠癌细胞系中TIP30基因表达的影响及伊立替康敏感性探讨

目的 探讨DAC及TSA对结肠癌细胞系中抑癌基因TIP30表达的影响,以及与伊立替康敏感性的关系.方法 DAC及TSA处理体外培养的结肠癌细胞系HCT116及HT29,RT-PCR法检测结肠癌细胞系HCT116及HT29药物干预前后抑癌基因TIP30表达情况的变化.MTT法检测结肠癌细胞株HCT116和HT29在不同浓度CPT-11下的凋亡情况,绘制生长抑制曲线并计算半数抑制浓度.结果 HCT116及HT29细胞系经DAC及DAC和TSA联合作用后使原来不表达或低表达的抑癌基因TIP30重新表达或表达增强;结肠癌细胞系HT29与HCT116相比伊立替康敏感性较强,DAC处理后2个细胞系伊立替康敏感性均增强.结论 TIP30基因的异常甲基化是结肠癌发生发展中的常见现象,结肠癌细胞系中TIP30启动子甲基化可能是基因失活的主要调控机制,DAC单独干预和DAC及TSA联合干预效果相似,均能显著增加高甲基化抑癌基因的重新表达.基因甲基化水平可能与化疗敏感性相关.     

人卵巢癌细胞HABP1的表达及其与侵袭转移能力的相关性

目的探讨透明质酸结合蛋白1（HABP1）在卵巢癌侵袭转移过程中的作用。方法分别用荧光实时定量RT—PCR和Western blot法检测HABP1 mRNA和HABP1蛋白在人卵巢癌细胞株HO-8910及高转移HO-8910PM细胞株中的表达,采用体外侵袭实验测定细胞侵袭能力。结果HO-8910PM中HABP1 mRNA和蛋白的表达水平均高于HO-8910,HO-8910PM的侵袭转移能力高于HO-8910。结论HABP1的高表达可能在人卵巢癌细胞的侵袭转移过程中发挥一定作用。     

GPR43调控Akt蛋白磷酸化抑制结肠癌细胞LAT1的表达

目的 分析GPR43在结肠癌中的表达情况，探究GPR43抑制结肠癌发生发展的可能作用机制。方法 采用qPCR方法检测人结肠癌细胞株HT29和HCT116中GPR43和LAT1 mRNA表达；留取本院结肠癌组织(16例),癌旁正常组织(16例),结肠腺瘤组织(15例)标本，IHC法检测各组织中GPR43及LAT1的蛋白表达情况；脂质体细胞转染技术敲低结肠癌细胞HT29(KD组)中GPR43基因，观察LAT1的表达情况；Western blotting检测Akt蛋白的表达水平，同时，设立GPR43的siRNA阴性对照(NC组)。结果 HT29细胞中高表达GPR43 mRNA的同时低表达LAT1 mRNA,而不表达GPR43 mRNA的HCT116细胞中同样高表达LAT1 mRNA;GPR43蛋白在癌旁正常组织、结肠腺瘤、结肠癌组织中的表达呈递减趋势(P<0.05),而LAT1蛋白表达呈递增趋势(P<0.05);在HT29细胞实验中，敲低GPR43后LAT1 mRNA表达明显升高(P<0.05),KD组中Akt蛋白的表达明显高于NC组。结论GPR43通过调控Akt蛋白磷酸化...     

沉默Tspan8对人结肠癌HT-29细胞移植瘤和转移灶中的Rap1、Rap1 GAP的影响

[目的]观察沉默四次跨膜超家族蛋白3(Tspan8)对人结肠癌HT-29细胞移植瘤和转移灶中Rap1和Rap1GAP蛋白的影响。[方法]通过生物信息学方法,结合R2平台中的1个基因芯片数据集,以Dukes分期筛选出自身表达与Tspan8表达显著相关的基因,利用KEGG工具对Tspan8相关的基因进行KEGG通路分析。利用慢病毒沉默技术沉默Tspan8在人结肠癌细胞株HT-29中的表达,RT-PCR及免疫组化技术检测HT-29细胞干扰后Tspan8沉默效果,构建结肠癌HT-29细胞转移动物模型。慢病毒沉默HT-29细胞中的Tspan8基因(shRNA+Tspan8+HT-29细胞)为实验组、空载体组为对照组,观察2组移植瘤生长情况。Western blot技术检测裸鼠肝脏转移灶中Rap1、Rap1 GAP的表达情况。[结果]与Tspan8相关的KEGG通路中,Rap1通路在DukeC期及DukeD期中与Tspan8表达存在相关性(P0.05)。RT-PCR结果表明Tspan8mRNA表达水平在实验组中较对照组明显下调(P0.05)。沉默Tspan8后,裸鼠肝转移瘤的数目减少、体积和重量变小,免疫组化结果提示实验组肝脏转移瘤组织Tspan8表达均较对照组小鼠明显减少(P0.05),Western Blot示Rap1、Rap1GAP在实验组肝脏肿瘤组织表达较对照组改变具有统计学意义(P0.05)。[结论]沉默Tspan8通过Rap1GAP影响Rap1蛋白活性抑制HT-29细胞肝脏转移。     

塞莱昔布对结肠癌细胞生长及肝转移瘤血管生长因子表达的影响

目的:探讨塞莱昔布对体外培养的结肠癌细胞生长及肝转移瘤模型血管生长因子(VEGF)表达的影响.方法:以人结肠癌细胞株HT-29,HCT-116为对象,体外药物敏感实验(MTT)法检测塞莱昔布对肿瘤细胞的增殖抑制效应,流式细胞术检测肿瘤细胞各细胞周期分布变化情况,肿瘤细胞接种裸鼠,观察肝转移瘤VEGF表达情况.结果:塞莱昔布对人结肠癌细胞株生长的抑制作用呈时间、剂量依赖性效应,且对HT-29细胞作用强于HCT-116细胞(P<0.01);塞莱昔布可改变结肠癌细胞株细胞周期的分布,明显降低增殖指数(P<0.05).塞莱昔布具有明显的抑制肝转移瘤VEGF表达的作用(P=0.00).结论:塞莱昔布可通过抑制COX-2酶活性而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖,诱导其凋亡,并抑制肿瘤血管生成,干预结肠癌的转移与复发.     

整合素ανβ6对结肠癌细胞胞外基质降解的调控作用

目的 探讨整合素ανβ6在结肠癌细胞侵袭中的作用,并揭示癌细胞调控胞外基质降解的相关分子机制.方法 利用质粒构建ανβ6特异性siRNA表达载体,细胞侵袭实验检测沉默ανβ6对结肠癌细胞HT29体外侵袭能力的影响;分别通过Western blot实验、明胶酶谱实验检测沉默ανβ6对结肠癌细胞胞外信号调节激酶(ERK)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)表达的影响;[3H]标记的Ⅳ型胶原降解分析检测沉默ανβ6对结肠癌细胞胞外基质降解能力的影响.结果 特异性siRNA表达载体可有效抑制HT29细胞中ανβ6的表达和结肠癌细胞的体外侵袭能力,显著抑制结肠癌细胞ERK1/2的表达,并抑制其活化形式磷酸化ERK1/2的表达;沉默ανβ6表达显著抑制结肠癌细胞uPA,pro-MMP-9和pro-MMP-2的分泌,以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)依赖的胞外基质降解.结论 整合素ανβ6通过MAPK信号通路调控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性,从而调控细胞外基质的降解,在结肠癌侵袭转移中发挥了重要作用.     

敲低CTCF对5-氟尿嘧啶、顺铂耐药结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制

目的 探讨敲低CCCTC结合因子(CTCF)对5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(DDP)耐药结直肠癌(CRC)细胞恶性生物学行为的影响及其机制。方法 体外传代培养CRC耐药细胞株HT29/5-Fu、HT29/DDP，筛选HT29/5-Fu、HT29/DDP细胞半数抑制活性(IC₅₀)时5-Fu或DDP浓度进行后续实验。选择HT29/5-Fu、HT29/DDP细胞，随机分为HT29/5-Fu shCTCF组与HT29/5-Fu shControl组、HT29/DDP shCTCF组与HT29/DDP shControl组，分别转染shCTCF或shControl，采用Western blotting法检测CTCF蛋白表达。取各组转染后细胞，采用MTT法检测细胞存活率，采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，采用Western blotting法检测Hedgehog信号通路补缀同源物1(PTCH1)、补缀同源物2(PTCH2)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(GLI1)、音猬因子(SHH)蛋白表达。结果 5-Fu对HT29/5-Fu细胞...     

siRNA沉默p28GANK对结肠癌细胞增殖的影响

背景：研究发现p28GANK表达与结肠癌恶性程度相关,其高表达提示预后不良。然而,p28GANK在结肠癌中的作用尚未完全明确。目的：探讨沉默p28GANK对结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：以针对p28GANK基因的慢病毒携带siRNA转染人结肠癌HT29细胞,以蛋白质印迹法检测干扰效果,以MTr法检测细胞增殖,以平板克隆实验检测细胞克隆能力,以流式细胞术检测细胞周期变化。结果：与HT29、Con—HT29细胞相比,Si—HT29细胞中p28GANK蛋白表达水平显著降低;细胞增殖速度显著减缓;细胞克隆数量显著减少;G0／G1期细胞比例显著增多,S期细胞比例显著减少,PI值显著降低（P〈0．05）。结论：沉默p28GANK在结肠癌细胞中的表达可抑制细胞增殖能力,使细胞周期阻滞。p28GANK可作为治疗结肠癌的新靶点。