紫杉醇对黑色素瘤细胞B16-F10细胞凋亡影响的机制研究

目的 探讨紫杉醇对黑色素瘤细胞B16-F10细胞凋亡的影响和作用机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测紫杉醇对B16-F10细胞增殖能力及细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡.结果 紫杉醇（0.001-10 μM）对B16-F10细胞表现出抑制作用,并且这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,随着浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用更为明显.低浓度对细胞周期G0/G1作用,而高浓度对G0/G1和G2/M均发挥作用.结论 紫杉醇对黑色素瘤细胞B16-F10具有明显促进凋亡的作用.紫杉醇可能作为黑色素瘤治疗的策略之一.     

IL-24对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

[目的]研究携带IL-24基因的真核表达质粒对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡和体外增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建含有IL-24基因的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞,用荧光显微镜观察其表达,在生物显微镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）法检测细胞凋亡,用MTT比色法检测B16细胞的体外增殖能力.[结果]荧光显微镜下观察到pEGFP-N1-IL-24可在B16细胞中表达;生物显微镜下显示转染IL-24基因的B16细胞皱缩、成团;AO/EB法检测显示转染IL-24的B16细胞核染色质着橘黄色或橙红色,并呈固缩状;MTT比色法显示IL-24明显抑制B16细胞的生长,与对照组相比较差异有统计学意义（P〈0.05）.[结论]外源性IL-24基因在体外对小鼠黑色素瘤B16细胞有显著的诱导凋亡和抑制增殖的作用.     

taurolidine对小鼠黑色素瘤细胞辐射敏感性的作用及机制

目的：研究taurolidine通过增强Bax和Bad蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，提高小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的辐射敏感性的作用及机制。方法：流式细胞仪检测0、10、25、50、100和150 μmol•L^-1 taurolidine诱导B16-F10细胞凋亡的百分比；细胞 克隆实验检测放射增敏性；Western blotting分析检测蛋白的表达。结果：50 μmol•L^-1 taurolidine作用于B16-F10细胞48 h，可诱导5%的细胞凋亡,随作用时间的延长及taurolidine浓度的增加，细胞凋亡的百分率增加（P<0.05）,呈显著的时效和量效关系；细胞克隆存活实验显示,当25 μmol•L^-1 taurolidine与2 Gy X射线照射联合作用B16-F10细胞时，与单纯给药组和单纯照射组比较，给药联合放疗组的细胞存活率显著降低（P<0.05），并随着药物浓度及照射剂量的增加细胞存活率进一步下降。随着taurolidine的浓度逐渐提高，小鼠黑色素瘤细胞放射增敏比（SER D₀和SER D_q）增高,50 μmol•L^-1 taurolidine组与10 μmol•L^-1组比较差异有显著性(P<0.05)；同时促凋亡蛋白Bax和Bad的表达增强，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降。结论：taurolidine联合X射线照射通过调节Bcl-2家族蛋白协同诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡，从而提高了放射敏感性。     

黄芪多糖对小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移的影响

目的 探讨不同剂量的黄芪多糖对小鼠B 16-BL6黑色素瘤肺转移的影响及机制.方法 采用B 16-BL6小鼠人工肺转移模型研究不同剂量黄芪多糖对黑色素瘤肺转移的影响;测量给药后小鼠免疫器官指数的变化探讨其可能的机制.结果 高剂量组的黄芪多糖能够显著抑制小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移,并能增加小鼠脾脏指数.结论 高剂量黄芪多糖可能通过增强免疫达到抗黑色素瘤细胞肺转移的作用.     

脂质体白细胞介素Ⅱ对小鼠b16黑色素瘤肺转移及脾细胞增殖…

小鼠尾静脉注射Ｂ１６黑色素瘤细胞，腹腔注射脂质体白细胞介素Ⅱ和未包裹白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２），连续ｄ，检测小鼠肺湿重、肺转移结节数和ＣｏｎＡ诱导的脾细胞ＤＮＡ掺入量。结果表明，ＩＬ－２可抑制小鼠Ｂ１６黑色素瘤肺转移，促进ＣｏｎＡ刺激的脾细胞增殖，并与剂量明显相关。脂质体包裹ＩＬ－２可使其生物活性提高约５倍。对免疫功能受抑小鼠作用更为明显。     

C57BL/6J小鼠及鸡胚B16细胞移植瘤血管生成拟态的观察及其MMP7和MMP9的表达

[目的]探讨黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中MMP7和MMP9的表达与血管生成拟态形成的关系,初步探讨宿主微环境对肿瘤细胞的影响.[方法]分别建立黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤模型,通过HE切片观察血管生成拟态的分布情况,利用免疫组化方法检测MMP7和MMP9的表达.[结果]B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中均可见血管生成拟态,并且前者显著多于后者.鸡胚移植瘤组织和小鼠移植瘤组织中MMP7的阳性细胞百分比分别为34.55±8.98和15.27±4.21,前者显著高于后者(P＜0.01),MMP9的阳性细胞百分比分别为16.38±3.34和10.53±1.95,前者显著高于后者(P＜0.01).[结论]鸡胚移植瘤可用于研究肿瘤生长早期的生物学行为,MMP7和MMP9的表达可能与肿瘤生长早期血管生成拟态的形成有关.     

高强度聚焦超声抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10在体内的转移

目的在黑色素瘤的小鼠模型上,探讨高强度聚焦超声（HIFU）处理对黑色素瘤细胞体内转移的影响。方法皮下注射小
鼠黑色素瘤细胞B16-F10以构建小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型;待肿瘤最长径长至7~10 mm时进行HIFU处理,并设置实验对
照组（荷瘤鼠辐照HIFU但保持治疗头功率源开关关闭,即假照组）;治疗后每3 d测量肿瘤长径和短径,共观察3周,绘制肿瘤曲
线,统计生存率和转移率,并通过实时荧光定量PCR测定血液中黑色素瘤细胞3个标志物的相对表达量以监测血液中循环黑色
素瘤细胞的数量,它们分别是黑色素瘤相关抗原A3（MAGE-A3）、T细胞1识别的黑色素瘤抗原（MART1）以及同源转化成对框
基因转录因子PAX3);在HIFU治疗后14 d,通过尾静脉注射再次移植B16-F10细胞,观测其肺转移率。结果（1）各自的中位生
存时间及95 %可信区间（CI）：假照组分别为19.00 d和17.14~20.86 d,HIFU组则分别为26.00d和24.76~27.25 d,生存率差异显
著（P<0.01）;从治疗后第20天起,两组小鼠的肿瘤体积差异明显,从HIFU处理后第20天开始,包括处理后第23、26天,辐照组
小鼠肿瘤体积明显小于假照组（P<0.05）;（2）实时荧光定量PCR结果显示HIFU组小鼠在治疗后第7天的MAGE-A3、MART1
和PAX3三个指标都明显低于假照组（P<0.05）,在治疗后第14天其MAGE-A3的表达量仍然明显低于假照组（P<0.05）;（3）在
HIFU治疗后14 d通过尾静脉再次移植相同肿瘤细胞,HIFU组肺转移灶的数量明显低于假照组（P<0.05）,肿瘤转移抑制率为
42.4%。结论HIFU处理能够抑制黑色素瘤细胞在体内转移的发生,其机制可能涉及减少肿瘤细胞从原发灶的脱落和瘤细胞在
肺部的定植能力。
     

紫杉醇对黑色素瘤细胞Bcl-2／Bax基因和蛋白水平影响及机制研究

目的检测紫杉醇对黑色素瘤细胞B16-F10细胞凋亡相关因子Bcl-2／Bax基因和蛋白水平的影响,探讨紫杉醇治疗黑色素瘤的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR和westernblot法检测紫杉醇对B16一F10细胞Bcl-2／Bax基因和蛋白水平的改变,以p—actin作为内参照。结果4pM紫杉醇对B16一F10细胞24h的Bcl-2／Bax基因和蛋白水平表现出明显的改变。与对照组相比,紫杉醇组Bcl-2基因mRNA水平相对量由（0．43土0．09）下降到（0．27士0．08）,两组有显著性差异（P〈0．05）。Bax基因mRNA水平相对量由（O．25士0．06）增加到（O．57士0．05）,两组差异有统计学意义（Pd0．01）。紫杉醇时B16-F10细胞Bcl-2蛋白相对表达量由（O．64士0．03）下降到（0．35士0．04）,两组差异有统计学意义（P〈O．05）。Bax蛋白的相对表达量由（O．41士0．02）增加到（O．73±0．03）,两组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论紫杉醇对可通过改变Bcl-2／Bax基因和蛋白水平发挥促进凋亡的作用。紫杉醇可能作为黑色素瘤治疗的策略之一。     

DMD模型小鼠基因突变及肌肉亚型表达特点研究

目的研究C57BL／10ScSn—Dmd^mdx／J模型小鼠子代基因突变情况及肌肉亚型的表达差异。方法选取2、3和4周龄C57BL／10ScSn—Dmd^mdx／J模型小鼠及C57BL／6J小鼠各3只，分别采集膈肌、背阔肌和腓肠肌的肌肉组织，利用RT-PCR方法扩增分析Dmd基因的结构特点；采用Western bolt方法分析β—dystroglycan的表达差异。结果模型小鼠基因编码抗肌萎缩蛋白基因（Dmd）的第3202位点出现C→T的自发突变，模型小鼠β—dystroglycan的表达比正常鼠有显著性升高。结论C57BL／10ScSn-Dmd^mdx／J模型小鼠的肌纤维在发育中出现断裂或是缺失，β-dystroglycan表达大幅度上调。     

核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

目的 构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响.方法 提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆.根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2 -EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组).RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化.结果 酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P＜0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P＜0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少.结论 成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力.     

缺失内质网驻留信号肽的小鼠钙网蛋白在B16-F1细胞中的表达

目的：克隆无内质网驻留信号肽的钙网蛋白（CRT）,构建表达分泌性钙网蛋白的B16-F1肿瘤细胞株.方法：以前期构建的小鼠钙网蛋白真核表达质粒为模板,采用突变PCR技术获得无内质网驻留信号肽的钙网蛋白cDNA并克隆入真核表达载体中.以脂质体转染法将该质粒转染B16-F1细胞后,用G418筛选单克隆细胞株.分别以PCR,WesternBlot法鉴定成功转染和表达分泌型CRT的B16-F1细胞株.流式细胞术分析该细胞株的细胞周期.结果：成功获得无内质网驻留信号肽编码序列的小鼠CRT真核表达质粒.稳定转染并筛选出表达分泌性钙网蛋白的B16-F1细胞株,CRT在此细胞株中表达并分泌至培养基质中.稳定转染前后的B16-F1细胞株细胞周期没有明显变化.结论：删除CRT编码序列中内质网驻留信号肽（KDEL）后,CRT失去了驻留在细胞内质网中的能力从而以分泌蛋白的形式出现在细胞外培养基质中.本研究为CRT的细胞外转移提供了一条新的途径,同时为以CRT为基础的抗肿瘤免疫研究提供了新的研究工具.     

条件培养基抑制L-抗坏血酸钠介导的小鼠黑色素瘤细胞凋亡

目的探讨肿瘤细胞B16F10通过自分泌对抗由L-抗坏血酸钠(VitCNa)介导的凋亡作用。方法常规在75 cm~2培养瓶中培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,待细胞长至90%～95%融合时吸取原DMEM/高糖培养液,用PBS反复清洗后加入无血清的DMEM/高糖10ml在培养箱中培养6～8 h,收集培养液用2500 r/min离心5min后上清用0.22μm滤器过滤,-20℃保存备用,在6孔板中每孔接种1×10~6 B16F10,常规培养24h后,实验组每孔加入2ml条件培养液(含有10%胎牛血清),对照组用普通培养液,两组均用10 mmol/L VitC Na促凋亡,分别在3、6、24 h观察细胞凋亡情况,hoechst染核,收集细胞免疫荧光检测caspase3和TUNEL、RT-PCR检测Bcl2表达。进而分离出条件培养液中相对分子质量大于5 000和小于5 000成分,分别煮沸,用蛋白酶K灭活后对B16F10促凋亡。结果发现条件培养基能够抑制VitC Na介导的小鼠黑色素瘤细胞B16F10凋亡,抗凋亡成分小于5 000,且不能被煮沸和蛋白酶K灭活,提示其是小分子抗凋亡物质。结论 B16F10可以分泌出拮抗细胞凋亡的小分子物质。     

Inhibitory Effect of Recombinant Fibronectin Polypeptide CH50 on Invasion and Metastasis of Melanoma B16 Cells

In order to investigate the inhibitory effect and mechanism of recombinant polypeptide CH50 on invasion and metastasis of melanoma B16 cells, the recombinant polypeptide CH50 was separated and purified by ion exchange chromatographic technique. The melanoma B16 cells treated with purified CH50 were cultured in vitro, the number was counted at 4, 24, 48 and 72 h and their morphological changes were observed in order to detect their adhesion and spreading abilities. In in vivo study, the melanoma B16 cells were labeled with CFSE and treated with CH50 and then they were injected into mice via mouse-tail veins. After 5 h, the lung tissues were fixed by frozen section. Accumulation and invasion abilities of B16 cells on lung tissues were observed under the fluorescent microscopy. The results showed that the morphological character of B16 cells treated with CH50 changed greatly and the number of B16 cells treated with CH50 decreased significantly (P<0.05). The adhesion and spreading abilities of B16 cells treated with CH50 were weakened obviously and the metastasis foci on lung tissues reduced. It was concluded that the recombinant polypeptide CH50 inhibited invasion and metastasis of melanoma B16 cells on tissues and could be a prospective bio-product in tumor general therapy.     

厌氧菌介导的肿瘤靶向自杀基因系统对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤作用研究

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应.方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24 h后取其上清液,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变.结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与空白对照组和pGEX组相比,CD组肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低.结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

NF-κB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞增殖及VEGF表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对鼠黑素瘤B16细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度的PDTC作用于B16细胞不同时间后,MTT法测定其对B16细胞增殖的抑制率,ELISA检测PDTC作用下B16细胞VEGF的表达情况。结果:经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P0.01);与对照组相比,PDTC作用后B16细胞VEGF表达降低(P0.01)。结论:PDTC具有显著抑制鼠黑素瘤B16细胞生长及VEGF表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。     

载阿霉素细胞膜纳米囊泡对黑色素瘤B16F10细胞的杀伤效应

目的：制备人胚胎肾细胞来源的细胞膜纳米囊泡（NVs）,其内腔载阿霉素（DOX）得到新型纳米药物载NVs细胞膜DOX（NVs-DOX）,探讨NVs-DOX的肿瘤细胞内吞作用及对黑色素瘤细胞的杀伤效应。方法：利用超速离心法提取HEK293细胞膜,脂质体挤出仪对细胞膜进行处理得到细胞膜NVs;应用电转化法将DOX担载于NVs的内腔,得到NVs-DOX,通过动态光散射检测NVs粒径。以不加囊泡细胞为对照组,细胞膜NVs为实验组,采用MTT法检测不同浓度（5、10、20、50和100 mg·L^-1）NVs对NIH3T3细胞的生物相容性。以小分子DOX（10 mg· L^-1）为对照组,不同浓度（0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500和1.000μmol·L^-1）NVs-DOX为实验组,采用荧光显微镜成像和流式细胞术检测NVs-DOX在黑色素瘤B16F10细胞中的荧光分布情况;细胞毒性实验,MTT法检测各组细胞存活率;活/死细胞染色法检测NVs-DOX（1 μmol·L^-1）处理后的B16F10细胞死亡情况。结果：利用细胞膜材料制备平均粒径为254.3 nm的NVs,电转化法得到了粒径约为289.6 nm的NVs-DOX。MTT法检测,不同浓度NVs组NIH3T3细胞存活率均>100%;荧光成像检测,药物孵育3 h后,NVs-DOX组细胞核内荧光强度略低于小分子DOX组;流式细胞术检测,NVs-DOX组的内吞效率（91.07%）略低于小分子DOX组（95.47%）;细胞毒性实验,NVs-DOX组与小分子DOX组均显示出对B16F10细胞浓度依赖性的杀伤效应,DOX浓度在0.1 μmol·L^-1时B16F10细胞存活率<20%,NVs-DOX组与小分子DOX B16F10细胞存活率比较差异无统计学意义（P>0.05）;活/死细胞染色,NVs-DOX组与小分子DOX组黑色素瘤B16F10细胞中死细胞占总细胞比率比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：成功制备了人胚肾细胞来源的细胞膜NVs及载DOX的新型纳米药物NVs-DOX,NVs-DOX具有较高的肿瘤细胞内吞效率及明显的黑色素瘤细胞的杀伤效应。     

IL-17对黑色素瘤B16F10细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨白细胞介素-17(IL-17)对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖和侵袭的影响。方法:体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞,选择对数生长期的细胞,在培养基中加入一定浓度的IL-17,并设空白对照组,MTT法检测IL-17对B16细胞增殖能力的影响;transwell侵袭实验检测IL-17对B16细胞侵袭能力的影响;明胶酶谱法分析IL-17处理后细胞MMP-2和MMP-9的表达活性。结果:IL-17处理组与对照组相比,B16细胞的增殖能力无变化(P>0.05)。transwell侵袭实验显示,IL-17处理组B16细胞穿膜细胞数明显增多(P<0.01)。明胶酶谱实验显示,IL-17处理后细胞MMP-2和MMP-9的表达活性增强(P<0.01)。结论:IL-17对黑色素瘤B16F10细胞的增殖能力无影响,但可促进细胞侵袭,可能通过增强MMP-2和MMP-9的活性而发挥作用。     

全反式维甲酸对小鼠黑色素瘤B16F10细胞生物学行为的影响

目的 探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对小鼠黑色素瘤B16F10细胞体外增殖、迁移、凋亡、致瘤性的影响及其初步作用机制.方法 采用MTT法检测ATRA对小鼠黑色素瘤细胞B16F10和小鼠成纤维细胞L929增殖能力的影响.显微镜下观察给药后两种细胞的形态变化,应用划痕实验和Transwell实验检测ATRA对B16F10细胞迁移能力的影响,分别采用DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色观察B16F10细胞凋亡情况,JC-1染色实验检测B16F10细胞线粒体膜电位,荧光分光光度计检测B16F10细胞中Caspase-9、Caspase-3的活化情况,利用体内成瘤实验观察ATRA对B16F10细胞致瘤性的影响.结果 MTT结果显示ATRA呈浓度依赖性地抑制B16F10细胞和L929细胞增殖,但B16F10细胞的存活率明显低于L929细胞的存活率(P＜0.05);分别以低、中、高3个浓度(6.25、16、40 μmol/L)的ATRA处理细胞24 h后,显微镜下可见B16F10细胞在中浓度时呈凋亡样改变,高浓度时细胞基本死亡,丧失正常形态;而L929细胞形态仅在高浓度时发生显著变化;划痕实验和Transwell实验提示B16F10细胞的体外迁移能力在中浓度即受到明显抑制(P＜0.05);继续以中浓度(16 μmol/L)的ATRA作用B16F10细胞24 h,DAPI染色可见细胞核裂解,甚至可见凋亡小体;AnnexinV-FITC/PI染色结合流式细胞仪测得细胞凋亡率为(37.27±4.42)％;JC-1染色实验提示线粒体膜电位明显降低;荧光分光光度计测得给药后Caspase-9、Caspase-3显著被活化,活性分别增加了(1.54±0.00)、(3.09 ±0.01)倍(P＜0.05);成瘤实验结果显示ATRA处理后的B16F10细胞致瘤性显著降低(P＜0.01),甚至消失.结论 ATRA能显著抑制B16F10细胞体外增殖、迁移能力,并能通过降低线粒体膜电位,活化Caspase-9、Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡,进而抑制B16F10致瘤性.