重组人Grn的克隆与表达

目的 :构建人Grn基因原核表达载体并观察其表达。方法 :从人单核细胞系THP-1细胞c DNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到p GEX-4T-2质粒载体上,再转化入感受态细胞TOP10,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析,测序正确的重组质粒再转化入感受态细胞DE3中表达蛋白,用Western blot鉴定结果。结果 :构建的p GEX-4T-2表达载体作PCR和双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与Grn序列设计完全一致,将其转化入DE3中,Western blot结果表明在细菌裂解上清有分子质量为91KD的融合蛋白。结论 :重组人Grn的克隆与表达成功,为进一步研究Grn的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

重组幽门螺杆菌AhpC基因的克隆表达及其初步纯化

目的克隆表达幽门螺杆菌（helicobacter pylori）AhpC基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出AhpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-11c中,重组载体pET-AhpC经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达.采用阴离子交换层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 PCR扩增的AhpC基因长度为597bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达98%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的28.7%,经纯化后,蛋白纯度达70%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了AhpC表达载体pET-AhpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达

目的　为进一步研究神经生长因子 (β- NGF)及其基因的结构及功能奠定基础。方法　自行设计合成一对特异引物 ,直接从人血细胞基因组 DNA中 PCR扩增出 NGF基因片段 ,克隆至 p GEM- T Easy载体 ,p GEM- T- NGF克隆片段再定向插入原核表达载体 p GEX- 5 T,构建的重组体 p5 TNF转化大肠杆菌 JM10 9并经IPTG诱导表达。结果　经限制性酶谱和 DNA测序确证 ,p GEM- T- NGF克隆片段为 β- NGF全长编码序列(380 bp) ;SDS- PAGE、分光光度计扫描和 Western印迹显示 ,p5 TNF转化菌有 40 .5× 10 3u特异区带 ,融合蛋白表达量为 5 0 3.2 mg/ L,占菌体可溶性蛋白总量 (7.4g/ L) 6 .8% ,该产物具 NGF抗原活性。结论　本研究成功克隆 β-NGF基因全长编码序列并在大肠杆菌中获稳定表达 ,同时证实国人 β- NGF基因编码无特殊性     

HBV X基因真核表达载体的构建研究

目的：构建HBVX基因与pCDNA3．1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBVX基因的功能奠定基础。方法：设计并合成HBVX基因的引物,从HBVDNA阳性的血清中,PCR扩增得到HBVX基因全序列,将其连接到真核表达载体pCDNA3．1上后,酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为下一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达简

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原（HBs）嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定。方法采用重叠拼接PCR法,将HCVAR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H—AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV—HA载体中,构建pCMV-HA-AR3-s真核表达质粒。脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Western blot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况。结果PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCVAR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24HAR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1128bp的AR3-S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA—AR3-S构建正确,Westernblot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3-S重组蛋白。结论成功构建pSVB-24H—AR3和pCMV—HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据。     

携带血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒的制备

目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)。方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定。利用Lipofectamine将pSNAV-rHO-1转染BHK-21细胞,G418筛选得到表达外源基因的细胞系BHK/rHO-1。用具有能表达Rap和Cap及包装重组AAV功能的一种重组单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2分别感染这株细胞系后收获并纯化病毒,DNA斑点杂交检测重组病毒滴度。结果:扩增了rHO-1基因,测序证实与GenBank中的一致,病毒滴度为1.5×1015v.g/L。结论:成功获得了高滴度、高纯度的重组AAV-rHO-1,这为以后心血管系统疾病的基因治疗研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建Nar1基因的酵母表达载体,并纯化His-Nar1融合蛋白,为进一步研究Nar1的相互作用蛋白及其功能奠定基础。方法:通过PCR扩增Nar1全长基因;通过定向克隆的方法将Nar1片段与载体pYES2/NTC连接;通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株INVSc1;再通过免疫沉淀的方法纯化His-Nar1融合蛋白;通过Western blot检测靶蛋白。结果:DNA测序验证穿梭表达质粒pYES2/NTC-Nar1构建成功,Western blot检测到融合蛋白His-Nar1的表达。结论:成功构建Nar1酵母过表达载体,并且可以有效表达融合蛋白His-Nar1。     

HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应

目的 利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1.经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用.结果 序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功.重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用.结论 可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a yeast expression vector of hepatitis B virus (HBV) PreS1 gene using the Sos-recruitment system (SRS), and evaluate the effect of the expression product on the growth of the yeast cells and activation of the reporter gene. Methods The coding sequence of HBV preS1 was amplified by PCR and cloned into the yeast expression plasmid pSos. The recombinant bait plasmid pSos- PreS1 was verified by sequencing before transformation into competent yeast cells. The effects of the expression product on the yeast cell growth and activation of the reporter gene were evaluated. Results The yeast expression vector of HBV PreS1 gene was constructed sucessfully. The recombinant bait plasmid showed no toxic effect on yeast cdc25H cells without a self-activation of the reporter gene. Conclusion The SRS can be used to study the proteins interacting with HBV PreS1 protein and provides a means for obtaining insight into the pathogenic mechanism of HBV.     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。