食蟹猴首次实验感染B病毒后的抗体反应和排毒

猴疱疹病毒(B病毒)是猕猴属动物的α-疱疹病毒,与人的单纯疱疹病毒(HSV)密切相关。猕猴的B病毒自然感染很象人HSV感染,首先在口腔或生殖道感染,然后出现血清阳性反应,病毒潜伏在神经节内。B病毒的严重性在于偶而可由猴染给人后引起致命的上行性脑脊髓炎。近年来在佛罗里达Pensacola(1984)和密执安州Kalamazoo(1989)发生的B病毒传染于人的事例,使人们对这种罕见但又重要的疾病提高了警惕。限制这种B病毒对动物管理     

人柯萨奇B2病毒感染恒河猴模型的初步研究

目的通过对人柯萨奇B2病毒经口腔感染恒河猴婴猴的感染特征进行初步分析研究,为人柯萨奇B2病毒恒河猴感染模型的建立提供实验方法及技术支持,为后续开展其感染机制、病理生理等研究奠定基础。方法将柯萨奇B2病毒经口腔感染方式感染3～4月龄的恒河猴婴猴,观察记录恒河猴临床症、体温;采集血液检测生理生化指标;血样和疱疹检测病毒;疱疹组织进行病理检测。结果恒河猴感染后2～5 d出现手、足、口疱疹;动物出现精神沉郁、活动及饮食量减少的情况;体温呈现稽留热曲线图;疱疹液和血样中都可检测到柯萨奇B2病毒;血常规检测出现白细胞减少、单核细胞增加、淋巴细胞数量减少、粒细胞数量增加、嗜酸性细胞增加、嗜碱性细胞减少的情况。血液生化检测发现肝功、肾功、心肌酶都发生了不同程度的升高;疱疹组织病理学显示恒河猴疱疹呈鳞状上皮增厚,表面角化过度,局部坏死伴炎细胞浸润,脓肿形成。结论人柯萨奇B2病毒感染婴猴后出现一系列较为特征的手足口疱疹、临床症状、生理生化、病毒血症等情况,表明经口腔感染方式恒河猴婴猴可以成功构建柯萨奇B2病毒感染的动物模型,建立的相关检测方法和技术是可行的,为后续建立开展恒河猴柯萨奇B2病毒感染模型、发病机制研究、药物及疫苗的评价奠定了实验基础。     

猴B病毒PCR检测方法的建立

目的　建立检测猴血B病毒的PCR方法。方法　根据MakotoH报道的引物 ,用PCR方法直接扩增猴血B病毒及扩增经Vero细胞培养后的猴血B病毒 ,扩增产物连于pGEM T载体。结果　这四对引物可同时对猴血B病毒及经Vero细胞培养后的猴血B病毒进行扩增 ,扩增结果一致 ,对扩增片段克隆测序的结果证实 ,其与美国猴B病毒E2 4 90株同源性为 10 0 %。结论　建立了从血样中直接检测猴B病毒DNA的PCR方法。     

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

简析猴B病毒在人类的致死性

非人灵长类动物与人类具有相似的遗传、解剖和生理结构,广泛应用于生物医学研究。猴B病毒(猴疱疹病毒1型)是一种非人灵长类所携带的人兽共患病原体,当感染其自然宿主恒河猴时没有明显的临床症状,但感染人类时,可引起人类致死性脑炎、脑脊髓炎和神经系统后遗症的发生。本文将简要分析猴B病毒感染人类造成严重后果的原因。     

不同方法检测猴B病毒的结果比较

目的比较血清学方法和PCR方法在猴B病毒检测中的差异,为猴B病毒防控提供依据。方法取16只猴血及三叉神经组织,制备血清、血液样品DNA和神经组织DNA,分别采用免疫酶方法和PCR方法检测血清中B病毒抗体及病毒DNA。结果 16只猴有7只为B病毒抗体阳性,而PCR方法仅在2只抗体阳性猴的三叉神经组织DNA中扩增出目的条带(UL1基因);测序结果显示,两个感染个体的B病毒扩增基因序列完全一致,但与B病毒标准毒株E24090的同源性只有93.43%。结论 B病毒抗体阳性猴不一定是病毒的携带者。     

表现神经症状的SIVmac251感染猴大脑基底节病毒gp120序列变异分析

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac251在中国恒河猴感染传代过程中产生的可能的神经侵袭性和神经嗜性及其分子机制。方法从静脉感染SIVmac251-155p6N的8只实验猴中出现严重神经症状的1只猴中,监测病毒及免疫指标变化,观察临床症状、猴脑组织病变,单拷贝PCR扩增病毒gp120序列并分析变异及糖基化位点变化情况。结果感染猴晚期出现明显艾滋病脑病症状,病理切片显示脑组织出现多核巨细胞及神经元变性、坏死。脑基底节分离出单一序列病毒,其氨基酸序列与血浆病毒及感染毒株SIVmac251-155p6序列差异主要位于Gp120的V1和V4区,并且在C1区66位出现一个糖基化位点缺失。结论SIVmac251在猴体长期传代过程中表现出神经嗜性毒株的特征,对AIDS脑病研究具有重要意义。      

恒河猴B病毒阳性率随季节变化的研究

目的 研究恒河猴BV感染率随季节变化的增长规律。方法 采用BV全病毒为抗原的ELISA试剂盒对两批离乳后群养的54只恒河猴仔猴每月采血检测BV感染情况,连续检测13个月。结果 12月、1月、2月、3月、4月B病毒阳性猴数量相对增加较明显,其他月份BV阳性猴数量相对稳定。结论 BV的感染受季节影响,春季BV的感染率相对较高,可在高发季节加强有关的预防措施或调控可改变的环境因素,降低BV的感染,提高猴群质量。     

SHIV-KB9感染中国恒河猴动物模型的建立

目的为了进一步确证SHIV-KB9感染中国恒河猴的病毒浓度范围,测试动物对病毒的适应性,明确该动物模型的可重复性。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流氏细胞术、血常规、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+T细胞数等证实,4.8×105 copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论本研究进一步明确了SHIV-KB9感染中国恒河猴的有效病毒浓度范围,确定了SHIV-KB9病毒感染中国恒河猴的病毒学、免疫学的测定指标,成功的建立了SHIV-KB9/中国恒河猴动物模型。     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

HIV-1感染的小动物模型

[目的]对感染SARS-CoV的恒河猴进行病毒、血清学等指标检测及研究,确定模型动物成功感染,并为SARS发病机制,疫苗评价,药物筛选确定参考指标。[方法]SARSCo-V经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。[结果]用巢式RT-PCR在感染后每天提取的咽拭子标本中检测SARS-CoV的RNA,以细胞培养冠状病毒为阳性对照,以正常恒河猴咽拭子为阴性对照,在8只动物病毒接种第5天开始可检测到大小为797bp的目的条带,阳性检出最长可持续到第15天。进一步用病毒分离实验对PCR结果进行确证,8只动物中的5只恒河猴接种5天的咽拭子标本中,经Vero细胞培养,细胞产生了典型细胞病变(CPE),提示SARS冠状病毒能感染恒河猴并有病毒的复制和排毒。IFA方法证实为SRAS-CoV抗原存在。SARS-CoV感染恒河猴后,可以检测出免疫反应。在SARS冠状病毒接种前和接种后第5、8、11、15、19、23、26、30、34、每隔4-7天以及安乐死时采血,制备血清测定抗体,8只恒河猴接种病毒前均血清中SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性,10天后安乐处死的5只感染猴在11-15天开始,至安乐死时,均为阳性。IgG阳性的5只恒河猴均有一定的中和抗体产生,且对SARS病毒感染细胞有一定的保护性。感染SARS病毒猴后与正常猴比较,其细胞杀伤效应明显增强。感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

病毒性肝炎的预防

病毒性肝炎是由多种病毒引起的肝脏疾患,临床上多见的为甲型、乙型和非甲非乙型肝炎三种,我国以甲型、乙型为多,甲型肝炎发病率最高。甲型肝炎病毒(HAV)属肠道微小病毒科RNA病毒,人及非人灵长类动物如黑猩猩、狨猴可感染HAV,在我国证明短尾猴(红西猴)和恒河猴也易感,HAV可在体     

猴免疫缺陷病毒急性及慢性感染淋巴结的病理变化

【目的】观察猴免疫缺陷病毒(SIV)急性及慢性感染猴淋巴结的病理改变，以掌握评价抗艾滋病药物、疫苗及免疫调节剂疗效指标，并探索猴艾滋病毒感染及猴艾滋病(SIV／SAIDS)的发病机制。【方法】采用SIVmax病毒急性及慢性感染恒河猴40只，先后分别在不同时间作淋巴结活检68例次及尸检死亡猴7只的淋巴结，对淋巴结进行病理常规切片、染色、光镜检查。【结果】淋巴结的病理变化可分为3个型：(1)增生型(感染后3～6或9个月)；(2)退化型(感染后6～12或14个月)；(3)耗竭型(11个月以上及部分中途死亡猴)。猴SIV感染的淋巴结病变与人HIV／AIDS的淋巴结的病变比较，两者的病变极为相似。【结论】猴SIV感染淋巴结病变的3个型可以作为猴艾滋病发生、发展和恶化的观察指标，SIV感染猴模型可以作为抗艾滋病药物、疫苗和免疫调节剂的疗效评价的动物模型和研究艾滋病发病机制的理想动物模型。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

SARS-CoV感染猴模型病毒学研究

建立SARS-CoV病毒分离培养方法,确定SARS-CoV病毒感染动物后在不同时间和不同组织病毒的复制和存活时间,并比较中国恒河猴和食蟹猴对病毒的敏感性,筛选出对SARS冠状病毒敏感的动物,完善SARS冠状病毒感染猴模型的病毒学指标。方法:SARS-CoV经鼻腔接种实验用猴,定期采集动物的鼻咽拭子、血浆和组织标本进行病毒分离培养,分离出来的病毒用免疫荧光方法和中和试验等方法进行测定。结果:SARS冠状病毒均可感染恒河猴和食蟹猴,在鼻咽拭子、血浆和组织中可以分离到病毒。结论恒河猴和食蟹猴均可作为SARS感染动物模型,而病毒分离培养可以作为感染模型的重要指标。     

恒河猴病毒学监测的研究

猕猴的病毒性疾病和潜在感染的病毒病原种类颇多。我们调查了10种危害较大的猴病毒在我国恒河猴中的感染率。检查方法有免疫酶染色法(IEA),间接免疫荧法(IFA), ELISA和血凝抑制试验(HI)等。结果:按感染率高低顺序为猴轮状病毒SA_(11)(124/128,96.9%),猴巨细胞病毒SCMV(110/126,87.0%),麻疹病毒(53/79,67.1%),猴B病毒HBV(352/886,     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期(5年)的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴(G0401V→G0402V→0403V),同时,剔除G0401V猴CD8+T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴(G0401V→G0404V),应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4+T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8+T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态，为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考，我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴，用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴，使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法，监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况，持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况，IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性，与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围，了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系，完善了SIV／SAIDS模型评价指标，为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

SARS灵长类动物模型

Greenough TC等人2005年8月在美国病理学杂志上报道了普通绒猴(Callithrixjacchus)感染SARS-CoV的试验结果。两组绒猴通过气管内感染含SARS-CoV的细胞培养物后,在第2、4、7天,动物出现了病理形态学改变和病毒复制。所有的动物都出现了多灶性单核细胞性间质性肺炎,多数动物伴有多核合体细胞、水肿、支气管炎。通过免疫组化的方法在肺泡巨噬细胞和I型上皮细胞中检测到了SARS病毒抗原。感染动物尸检中,在支气管淋巴结和心肌中都检测到了病毒RNA,并有炎性改变。多数动物还出现了肝炎,以多灶性淋巴细胞性感染为主,伴有个别肝细胞的坏死…