卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素(IL)-2的重组卡介苗(BCG)。方法 分别以BCG和IL-2cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和399bp的IL-2基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌-BCG穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将IL-2基因克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIL-2。结果 质粒pMSIL-2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和IL-2正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIL-2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL-2，该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

卡介苗穿梭质粒pMSIFN-α2a的构建与鉴定

目的 构建分泌性表达IFN-α2a的卡介苗重组质粒。方法 分别以卡介苗（BCG）和IFN-α2a cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG-Ag85B信号肽序列和495bp的IFN-α2a基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌．卡介苗穿梭表达载体pMV261重组，得到重组质粒pMS。再将IFN-α2a基因序列克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIFN-α2a。结果 质粒pMSIFN-α2a用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B和IFN-α2a正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIFN-α2a可望在BCG中分泌性表达细胞因子IFN-α2a，从而促进IFN-γ的释放，该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达(英文)

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获得质粒pMVZ2A,将其电转化卡介苗,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其结果进行分析。结果信号序列与LMP2A和BZLF1融合基因被正确插入分泌表达载体pMV261。重组质粒经限制性内切酶双酶切、PCR扩增、基因测序等鉴定。蛋白纯化后可得到一条带。结论 pMVZ2A在BCG中能够分泌表达,本研究为获得抗结核杆菌和EB病毒的双价疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的　构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法　分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果　质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论　重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达

目的 构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗.方法 分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS.然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获...     

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。     

分泌人干扰素α-2a的重组卡介苗的构建、表达与鉴定

目的 构建分泌人干扰素α-2a（IFNα-2a）的重组卡介苗（rBCG）。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术从卡介苗基因组中扩增出Ag85B的信号肽基因序列,从pBIFNα-2a质粒中扩增出IFNα-2acDNA全长序列。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pMV261结核杆菌HSP60启动子下游,构建一个分泌型的卡介苗穿梭表达质粒pMSIFNα-2a。利用电穿孔技术将质粒pMSIFNα-2a转入卡介苗得到rBCG,分别用PCR扩增和Western印迹检测rBCG菌体和培养上清中IFNα-2a的DNA和蛋白表达,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测rBCG培养上清中IFNα-2a的含量。结果 酶切鉴定、PCR扩增和DNA测序分析结果均表明,所克隆的信号肽DNA片段和IFNα-2a片段与文献结果完全一致,pMSIFNα-2a的连接方向正确,阅读框与预期完全一致。以rBCG质粒DNA为模板,通过PCR扩增得到IFNα-2a的基因片段,Western印迹证实rBCG分泌的蛋白能与人IFNα-2a的抗体特异性结合,ELISA法检测到rBCG培养上清中高含量的IFNα-2a（324.57pg／ml）。结论 构建的rBCG能够分泌具有功能活性的细胞因子IFNα-2a,有望成为膀胱肿瘤免疫治疗的一种有效方法。     

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。     

Ag85a-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗.方法 通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85a的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗.结果 通过PCR扩增获得约800 bp的ag85a基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明ag85a基因正确插入到pYUB295质粒中.将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好.pYUB295-ag85a重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明:ag85a-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85a蛋白在卡介苗中分泌表达.结论 成功构建了ag85a-卡介苗重组疫苗.     

GM-CSF与BZLF1融合基因修饰的重组BCG的构建与表达

目的将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(GM-CSF)与EB病毒即刻早期基因(BZLF1)重组为融合基因GCBF,并转化入卡介苗(BCG)中进行表达。方法用随机引物Oligo(d T)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和BZLF1编码序列的c DNA。将纯化GM-CSF和BZLF1 PCR扩增产物插入分泌表达载体p MV261,并转化入感受态细胞Escherichia coli DH5α(E.coli DH5α),在LB培养基上进行卡那霉素抗性选择,测序正确的序列进行剪接式重叠延伸,将目的基因GM-CSF和BZLF1编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接,构建融合基因GCBF,将GCBF克隆至p MV261,转化感受态细胞E.coli DH5α,在LB培养基平板上进行卡那霉素抗性选择,阳性克隆提取质粒后转化感受态BCG,western-blot检测GCBF在r BCG中的表达。结果目的基因GM-CSF和BZLF1 RT-PCR产物大小分别为461 bp和788bp,与预期值一致。构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实,融合基因GCBF(1209bp)正确插入载体,成功转化入BCG感受态细胞,且被正确表达。结论融合基因GCBF修饰的r BCG构建及表达成功,为进一步探讨r BCG杀伤EB病毒阳性肿瘤的免疫活性研究奠定了实验基础。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。