成骨生长肽促成骨作用的研究进展

成骨生长肽（OGP）具有促成骨作用,具有较大的潜在临床应用价值,是国内外研究的热点。动物体内实验和体外细胞实验表明,OGP能促进骨密度增加,加速骨折愈合,促进体外培养大鼠成骨细胞的成骨功能,增加核心结合因子α1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平,促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,上调成骨标志物的表达。文章对OGP促成骨作用的研究进展进行综述。     

成骨生长肽促成骨作用的研究进展

成骨生长肽（OGP）具有促成骨作用,具有较大的潜在临床应用价值,是国内外研究的热点。动物体内实验和体外细胞实验表明,OGP能促进骨密度增加,加速骨折愈合,促进体外培养大鼠成骨细胞的成骨功能,增加核心结合因子α1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平,促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,上调成骨标志物的表达。文章对OGP促成骨作用的研究进展进行综述。     

骨髓基质干细胞与成骨的研究进展

实验证实骨髓基质干细胞具有间充质干细胞的特性，表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能，可向成骨系细胞方向分化。在体外培养时具成骨细胞样细胞表型，植人体内可产生矿化骨组织。本文对其体内外成骨实验进展作一综述。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖分化的影响

目的 研究成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.方法 在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中加入不同浓度的OGP(10-11～10-7 mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测细胞内核心结合因子1(Cbfa1) mRNA的表达.结果 OGP对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P《0.05),最大效应浓度为10-9 mol/L;能增加细胞内ALP活性(P《0.05),最大效应浓度为10-8 mol/L;可诱导Cbfa1 mRNA的表达(P《0.05).结论 OGP可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内Cbfa1 mRNA的表达促进其成骨向的分化.     

兔骨髓基质干细胞的培养及成骨诱导研究

目的观察体外培养条件下兔骨髓基质干细胞的主要生物学特性及向成骨细胞分化的能力。方法取兔股骨,冲洗骨髓腔,进行细胞的贴壁体外培养,培养至第四代加入含成骨诱导剂的DMEM培养基与空白组为对照组;噻唑蓝（MTT）检测两组骨髓基质干细胞的增殖能力,进行成骨细胞的钙结节茜素红染色与I型胶原的免疫组化染色。结果骨髓基质干细胞7-14 d可见少量的集落形成,24 d时观察见细胞基本铺满瓶底。在矿化液条件下培养1周左右,细胞间出现了致密圆形团,同时细胞的增殖能力较常规培养有所降低;茜素红染色结果显示矿化细胞间出现的致密的、圆形不透光团块呈现片状的棕染,着色区域,I型胶原的免疫组化染色强阳性。结论贴壁筛选法培养骨髓基质干细胞,操作简单,细胞易于成活,不失为一种良好的方法;虽然矿化液可使其向成骨细胞转化,但增殖速度变慢。     

人胚胎骨髓基质干细胞的长期培养及体外成骨特性

研究了人胚胎骨髓基质干细胞(hBMSCs)在体外长期培养时的基本特性和向成骨细胞的分化能力。结果表明：前三代hBMSCs多数呈长梭形,生长快速,增殖能力强;而后几代细胞变得比较扁平,生长缓慢,增殖能力下降;至第六代,细胞已失去增殖能力。每一代细胞生长均分为延滞期、对数生长期和稳定期,延滞期一般为6～7d,对数生长期为4～5d,最后是稳定期。前三代细胞对数生长期的群体倍增时间(PD71)基本相同,而第四代细胞的PDT略有上升,第五代细胞的PDT最大。在体外扩增能力方面,前三代细胞均可以扩增18倍左右,而第四、第五代细胞则下降至11倍、5倍。实验结果表明扩增后的细胞经过诱导可以形成钙化小结,与未诱导细胞相比碱性磷酸脂酶(ALP)活性显著提高。     

兔骨髓基质干细胞诱导成骨的实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法:使用密度梯度法分离骨髓基质细胞并进行培养,传2代后运用成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠(β-Gp)、L-坏血酸(AA)进行诱导,测试骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果:形态学表明骨髓基质细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,诱导后细胞生长较前明显减慢,逐渐变为立方形、锥形或梭形。汇合时细胞呈铺石状重叠生长,进而形成“钙结节”样表现。染色及电镜观察可见细胞诱导前后有明显区别,细胞增殖吸光度(OD值)及细胞碱性磷酸酶测试表明,随着时间的延长,细胞增殖变慢,但分化能力增强(P<0.05)。结论:骨髓基质细胞作为构建组织工程骨的种子细胞在地塞米松、β-甘油磷酸、L-坏血酸诱导下成骨具有可靠的重复性。     

细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展

骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)被认为是骨组织工程中最有应用前景的理想种子细胞[1].由于BMSCs具有分化多方向性的特点,而骨组织工程学要求其向单一方向分化,所以,BMSCs的定向诱导具有重要作用.就其成骨方向来说,常用的具有诱导作用生长因子有骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等.它们不仅可单独作用,相互之间也存在着密切的关系,可复合使用.本文就细胞生长因子对BMSCs分化及增殖的诱导作用作一综述.     

成骨生长肽对不同血清浓度下OPG-/-小鼠骨髓基质细胞增殖和分化作用

 目的 研究合成成骨生长肽（synthetic osteogenic growth peptide,sOGP） 对在不同血清浓度条件下OPG-/-小鼠骨髓基质细胞（bone marrow derived stroma cells,BMSCs）的增殖和分化作用。方法 取OPG-/-小鼠股骨,分离骨髓基质细胞进行体外培养。在各自培养条件下分为实验组（OGP组）、空白对照组（CON组）和阳性对照组（bone morphogenetic protein-2 group,BMP-2组）,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化、MTT法测定细胞增殖率、PNPP法测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的表达。结果 OGP在含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的LG-DMEM和矿化液的培养条件下,对OPG-/-小鼠BMSCs 起到增殖作用,在第3、5天均高于CON组和BMP-2组（P<0.05）;OGP组对ALP表达的影响与CON组相似,而与BMP-2组存在较大差异,BMP-2组在所有不同血清浓度条件下的第3、5天ALP活性均高于CON组和OGP组（P<0.05）。结论 OGP组对OPG-/-小鼠BMSCs的增殖作用要求较高血清浓度的体外培养条件,但在ALP的分化活性方面弱于BMP-2组。     

Antagomir-30d对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨miR-30d拮抗剂（antagomir-30d）正性调控大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨分化作用并确认转染的最佳浓度。方法：BMSCs培养并分组,分为不同浓度的antagomir-30d（antagomir-30d组）、阴性对照（NC组）和未做转染的BMSCs（空白组）;将不同浓度的antagomir-30d及其NC转染至BMSCs后进行成骨诱导。通过RT-PCR技术进行比较,测定成骨基因碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、Runt相关转录因子2（RUNX2）的mRNA的表达情况,并确定最佳转染浓度及其转染效率。通过ALP染色验证antagomir-30d对成骨分化的调控作用。结果：RT-PCR结果表明,antagomir-30d体外可以促进BMSCs的成骨分化。不同浓度antagomir-30d组的成骨基因表达量随浓度变化而改变,当antagomir-30d转染浓度为150 nmol/L时,ALP、OC、RUNX2的mRNA水平均显著高于空白组和NC组（P＜0.05）。Antagomir-30d的转染最佳浓度为150 nmol/L,此时ALP染色结果显示其活性最高,成骨分化作用好。结论：Antagomir-30d体外正性调控BMSCs的成骨分化,其转染至BMSCs的最佳浓度为150 nmol/L。     

Electromagnetic Field Change the Expression of Osteogenesis Genes in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

In order to identify the differentially expressing gene of bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） stimulated by electromagnetic field （EMF） with osteogenesis microarray analysis, the bone marrow MSCs of SD rats were isolated and cultured in vitro. The third-passage cells were stimulated by EMFs and total RNA was extracted, purified and then used for the synthesis of cDNA and cRNA. The cRNA of stimulated group and the control group was hybridized with the rat oligo osteogenesis microarray respectively. The hybridization signals were acquired by using X-ray film after chemiluminescent detection and the data obtained were analyzed by employing the web-based completely integrated GEArray Expression Analysis Suite. RT-PCR was used to identify the target genes： Bmp1, Bmp7, Egf and Egfr. The results showed that 19 differentially expressing genes were found between the stimulated group and the control group. There were 6 up-regulated genes and 13 down-regulated genes in the stimulated group. Semi-quantitative RT-PCR confirmed that the expressions of Bmpl, Bmp7 mRNA of the stimulated group were up-regulated （P〈0.05） and those of Egf, Egfr were down-regulated （P〈0.05）. It was suggested that the gene expression profiles of osteogenesis of the bone marrow MSCs were changed after EMF treatment. It is concluded that the genes are involved in skeletal development, bone mineral metabolism, cell growth and differentiation, cell adhesion etc.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

miR-125b通过靶向抑制Smad4调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的: 研究miR-125b是否通过调控其预测的靶基因Smad4表达而调节骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化。方法: 构建Smad4 3'-UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-125b对Smad4 3'-UTR-荧光素酶活性的影响;分离培养人骨髓MSCs,在MSCs中转染miR-125b mimics并进行成骨诱导,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测Smad4表达水平;Smad4 siRNA转染MSCs并进行成骨诱导,通过检测碱性磷酸酶(AKP)活性及RUNX2 mRNA表达水平变化考察Smad4下调对MSCs成骨分化的影响。结果: 双荧光素报告检测显示miR-125b能特异性地与Smad4 mRNA的3'-UTR结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。过表达miR-125b能抑制MSCs成骨分化过程中Smad4表达水平。干扰Smad4表达能抑制AKP活性及RUNX2 mRNA表达水平,它能部分模拟miR-125b调控MSCs成骨分化的功能。结论: miR-125b通过抑制靶基因Smad4的表达调控MSCs成骨分化。     

Ectopic osteogenesis and scaffold biodegradation of tissue engineering bone composed of chitosan and osteo-induced bone marrow mesenchymal stem cells in vivo

Background Chitosan （CS） scaffolds combined with osteogenically induced bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） have been proved to be promising substitutes for repairing bone defects.Nevertheless,the bone-forming and scaffold-biodegrading processes are seldom studied.This study aimed to determine the osteogenic ability of CS/osteoinduced BMSC composites by observing the bone-forming process and explore the relationship between bone formation and scaffold biodegradation.Methods The CS/osteo-induced BMSC composites （CS＋cells group） and the CS scaffolds （CS group） were,respectively,implanted into SD rat thigh muscles.At 2,4,6,8,and 12 weeks postoperatively,the rat femurs were scanned by CT,and the CT values of the implants were measured and comparatively analyzed.Subsequently,the implants were harvested and stained with hematoxylin and eosin and Masson trichrome,and the percentages of bone area,scaffold area,and collagen area were calculated and compared between the two groups.Results The imaging results showed that the densities of implants of the two groups gradually increased along with time,but the CT values of implants in the CS＋cells group were much higher than in the CS group at the same time point （P ＜0.05）.The histological results showed that the de novo bone and collagen formed in the pores of the scaffolds and gradually increased since 2 weeks postoperation in both groups,and the scaffold gradually degraded along with the boneforming process.However,the comparative analysis results showed that the CS＋cells group gained more de novo bone and collagen formation and had less scaffold than the CS group at the same time point （P ＜0.05）.Conclusion The CS/osteo-induced BMSC composites are excellent bone tissue engineering substitutes,and the scaffold biodegradation is accordant with the bone formation.     

骨形态发生蛋白-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法体外分离培养4周龄大鼠BMSCs,取第3~4代,用细胞碱性磷酸酶标法检测不同浓度Sr作用下碱性磷酸酶(ALP)活性的表达;用茜素红染色法检测钙结节的表达;用Western blot测定BMP-7的表达水平。结果在0.1~3.0 mmol/L的浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性,其浓度为3 mmol/L时,ALP活性表达最高,并明显促进钙结节的表达;Sr(0.1~3.0 mmol/L)呈浓度依赖性地上调BMP-7表达,其中浓度为3 mmol/L时,BMP-7表达最高;BMP-7阻断剂(noggin)(100 ng/ml)不仅抑制Sr诱导的BMP-7表达,而且使ALP活性及钙结节的表达明显下降。结论 Sr可通过上调BMP-7表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨能力的影响.方法 取大鼠骨髓组织,密度梯度离心法体外分离培养BMSCs.取第3代细胞接种,分别加入含0.5％、1％、2％、5％、10％ PRP的成骨诱导液或DMEM培养基进行培养,并以加入不含PRP的成骨诱导液或DMEM培养基培养(0 PRP)的BMSCs作对照.采用XTr比色法测定BMSCs的增殖情况.分别于培养3、7、11d时用ELISA法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,培养7、14、21 d时用放射免疫法检测骨钙素(OCN)表达量,培养21 d时用茜素红染色观察钙化结节形成能力.结果 成骨诱导培养的前7d,PRP可促进BMSCs增殖,成骨诱导培养7d以后,PRP也可促进BMSCs的成骨分化,且随着PRP浓度的增加,促细胞增殖、分化和成骨能力逐渐增强.PRP促进BMSCs内ALP活性和OCN表达的作用也呈剂量依赖性.成骨诱导培养21 d后,5％、10％的PRP诱导钙化结节形成能力优于0.5％、1％和2％的RPR,0 PRP培养的BMSC仅见少量钙化结节形成.结论 在体外成骨诱导培养条件下,RPR能有效促进BMSCs的生长增殖和成骨分化,以浓度10％为最佳.     

阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的探讨阿仑膦酸钠(ALN)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化能力的影响,观察其促BMSCs骨向分化过程中对转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果 ALN最佳促BMSCs增殖和骨向分化浓度为1×10-8mol/L,该浓度ALN能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;具有促BMSCs骨向分化能力的ALN各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论 ALN能促进BMSCs增殖和骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一。