新生隐球菌形态学实验方法的改进

新生隐球菌 (Ｃｒｙｐｔｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ)是常见深部感染真菌。其典型的形态特征是单细胞结构 ,可见芽生细胞 ,细胞外围具宽厚的荚膜[1] 。通常的教学实验方法是将该菌培养液接种于小白鼠脑内 ,经 1～ 2周再解剖小鼠 ,取脑组织压片在显微镜下观察其形态特点。因实验小鼠需较长时间的隔离饲养 ,脑组织压片不易寻找到观察目标等 ,实际工作很不方便 ,实验效果也常不理想。据文献报导该菌荚膜层可于培养过程中由菌体大量向外分泌而成[2 ] ,作者试用改良沙保琼脂培养与乳酸酚棉兰等染色相结合的方法进行观察 ,结果较为满意 ,现报…     

隐球菌性脑膜炎的临床表现及墨汁染色联合隐球菌抗原检测的诊断意义

目的 探讨隐球菌性脑膜炎的临床表现及墨汁染色联合隐球菌抗原检测的诊断意义.方法 选取2018年1月至2019年6月本院收治的中枢神经系统感染患者40例.其中10例隐球菌性脑膜炎患者作为观察组,其他30例中枢神经系统感染患者作为对照组,比较两组患者临床症状表现.采用墨汁染色法和墨汁染色联合隐球菌抗原检测(联合检测)患者脑...     

21例CNM脑脊液新生隐球菌的实验检测分析

目的检测新生隐球菌性脑膜炎(CNM)患者脑脊液(CSF)中的新生隐球菌,探讨几个方法的形态特征。方法对21例CNM患者CSF应用细胞计数器直接观察、瑞氏染色、印度墨汁涂片、革兰染色及培养后等实验室方法检测,并比较其阳性率和形态特征。结果隐球菌检测阳性率分别为真菌培养90.5%,印度墨汁染色81.0%,瑞氏染色和细胞学计数各为61.9%,革兰染色42.9%;墨汁涂片检测可显示荚膜和出芽;瑞氏染色可发现其周围毛刺;革兰染色仅现菌体深染。结论在基层医院细胞镜检计数、瑞氏染色、革兰染色及墨汁涂片法与真菌培养的正确、灵活结合可提高CSF中隐球菌的阳性检出率。     

新生隐球菌稳定载体的构建

新生隐球菌是一种具有荚膜、能在免疫功能低下人群中引起致命的系统性疾病的酵母真菌。要研究新生隐球菌致病的分子生物学机制 ,必须有一个相应的遗传学操作系统 ,而稳定的转化载体是其中的一个重要组成部分。该载体除了有用以识别的选择性标记外 [1 ] ,必须有较高的转化效率 ,并且有自身的稳定性。我们曾用带有 URA 5基因的质粒 p Cntell作为新生隐球菌转化系统中的载体 ,但该质粒没有自主复制序列 (autonomously replicating sequence,ARS) [2 ] ,转化效率及稳定性较低 ,不利于筛选新基因及对基因的功能进行研究。因此 ,我们尝试构建了…     

氯喹体外抗新生隐球菌的实验研究

目的:研究氯喹体外单独以及与两性霉素B(AmB)联合应用对新生隐球菌生长的影响.方法:(1)不同浓度氯喹分别与两种新生隐球菌变种的菌悬液共培养,检测4、6、8 h后菌悬液浓度的变化,并与不含氯喹的菌悬液对照比较;(2)检测3种浓度氯喹与AmB联合后对10株菌株的敏感性变化.结果:(1)在与隐球菌菌悬液共同孵育4、6和8 h时,50 μmol/L以下浓度的氯喹培养与生长对照之间隐球菌的生长百分率差异不显著;而在50～100 μmol/L浓度时,氯喹培养与生长对照之间隐球菌的生长百分率差异显著;氯喹浓度在500 μmol/L以上时,氯喹与隐球菌共孵育后,隐球菌菌悬液的浓度甚至低于原先浓度.但氯喹对隐球菌两种变种的作用没有差别.(2)氯喹与AmB联合应用可以明显降低AmB的MIC,而且也随着剂量增长而增强.结论:高浓度氯喹在体外具有抑制隐球菌生长和杀灭隐球菌的作用,并可增强AmB的抗隐球菌能力.     

T淋巴细胞与新生隐球菌免疫

T淋巴细胞在新生隐球菌的免疫中有重要的地位,通过多种机制发挥抵御新生隐球菌的作用。本文就T淋巴细胞与新生隐球菌免疫的研究进展和作用机制进行综述。     

小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染的实验研究

目的:建立原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染模型,探讨免疫抑制状态在小鼠皮肤隐球菌感染形成中的作用.方法:24只BALB/c小鼠,随机均分为免疫抑制组(腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺)和未抑制组.将新生隐球菌标准野生株B3501分别以5×107/ml皮内接种于两组小鼠,观察病程,记录皮损形成与消退时间,并进行皮损组织真菌培养与病理检查.结果:两组小鼠均于接种菌悬液后2～9 d[免疫抑制组(3.42±1.17) d、未抑制组(4.25±1.42) d]产生了结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损,并均于接种后22～44 d[免疫抑制组(36.75±4.20) d、未抑制组(29.00±4.75) d]自愈.免疫抑制组小鼠皮损形成时间与未抑制组无显著性差异,而消退时间晚于未抑制组(P<0.05).皮损组织真菌培养与病理检查均确证为隐球菌感染.结论:BALB/c小鼠皮下接种隐球菌后发生原发性皮肤感染,可以作为研究本病的动物模型.免疫抑制可能并不是原发性皮肤隐球菌感染的易感因素.     

新生隐球菌特异性探针的筛选

建立新生隐球菌质粒克隆库并从中筛选特异性探针。方法首先以Ａ型新生隐球菌标准株为实验菌株，以质粒ｐＵＣ１８为载体，大肠杆菌ＪＭ１０３为宿主，构建了新生隐球菌质粒克隆库Ａ（ｐＣＮ）。然后以在临床上，需要与隐球菌病鉴别的感染性疾病的病原菌，以及生物学性状与新生隐球菌相似的真菌为鉴别系统，应用双重杂交法筛选特异性克隆。结果克隆库的克隆片段大小为２８０ｂｐ～１８００ｂｐ，平均５８０ｂｐ，其中３２．４３％（１９２个克隆）为重复序列，６７．５７％（４００个克隆）为单拷贝序列。从该克隆库中筛选出３个特异性克隆，即ｐＣＮⅡＡ６为Ａ型特异性，ｐＣＮⅡＢ５为种特异性，ｐＣＮⅢＧ１为新生变种特异性。结论应用种特异性探针可以对新生隐球菌感染进行早期快速诊断，型特异性探针和变种特异性探针可用于流行病学调查区分血清型和变种。     

新生隐球菌的磷脂酶活力检测

目的 :评价不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌磷脂酶的活力情况。方法 :分别在 30℃和 37℃下用蛋黄平板法培养不同来源的 4 0株新生隐球菌菌株 ,测量其产生沉淀圈的大小 ,计算 PZ值来比较其磷脂酶活力的不同。 结果 :4 0株菌中有 39株能在其菌落周围产生明显沉淀圈 ,PZ值在 30℃和 37℃培养条件下分别为 (0 .5 2 9± 0 .12 1)和 (0 .5 2 3± 0 .14 3) ,两者差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;在 37℃培养条件下 ,血清 A、B、AD和 D型菌株的 PZ值分别为 (0 .5 4 1± 0 .116 )、(0 .5 18± 0 .0 36 )和 (0 .4 72± 0 .0 5 1) ,3组间差异均无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;临床株和环境株 PZ值分别为 (0 .5 0 1± 0 .0 4 9)和 (0 .5 6 5± 0 .131) ,差异有显著性意义 (P<0 .0 5 )。结论 :温度对新生隐球菌磷脂酶活力没有影响 ;不同来源的新生隐球菌菌株的磷脂酶活力差异较大 ,其中临床分离株比环境分离株磷脂酶活力强 ;而不同血清型菌株的磷脂酶活力无差别。     

热灭活隐球菌对小鼠隐球菌脑炎的作用及其机制

目的：研究脑内接种热灭活的隐球菌(heat—inactived Cryptococcus neoformans,H-CN)在中枢神经系统隐球菌感染中的作用及对小鼠脑和脾IL—2、IL—6基因表达的影响。方法：实验动物随机分为实验组(先给予两次脑内接种H—CN)和对照组(先给予两次脑内接种生理盐水)，然后分别取两组中部分小鼠的脑和脾用RT—PCR方法检测IL—6mRNA和IL—2mRNA基因表达，同时给予两组剩余小鼠脑内接种致死量的隐球菌，观察小鼠脑组织病理改变。结果：小鼠脑组织总RNA以IL—6和IL—2引物进行RT—PCR，实验组IL—6表达阳性，IL—2表达阴性，对照组IL—6、IL—2均表达阴性。小鼠脾组织总RNA以IL—6和IL—2两种引物进行RT—PCR，两组IL—6、IL—2均表达阴性。实验组小鼠脑组织病理与对照组相比可见侧脑室的隐球菌周围有大量的炎性细胞浸润。结论：脑内接种H—CN可引起中枢神经系统特异性免疫反应，中枢神经系统抗隐球菌机制很可能与H—CN引起局部细胞因子IL—6的分泌有关。     

新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株。方法：(1)用体外基因重组技术将G418抗性基因插入到新生隐球菌1．2kb的ura5基因中;(2)用电转化方法将体外重组片段导入受体菌;(3)利用5-氟乳清酸(5-FOA)反筛选法筛选ura5突变株;(4)用遗传学鉴定营养缺陷株的方法鉴定突变体。结果：1株突变株ura5基因的序列与重组片段相同;其Southern杂交显示在20kb和7kb处出现2条杂交条带;该突变株能在SDU、SDU和YEPD／G418平板上生长,不能在SD平板生长;其生长曲线显示突变株生长速度依赖于尿嘧啶的提供量。结论：获得了1株新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株,建立了新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株转化系统,为CAP64基因的功能研究提供了工具。     

染制神经终末的Akmstrong铬—银方法的改进

本文对染制神经终末的Akmstrong铬—银方法进行了改进,其改进后的实验特点为:将固定和媒染两个步骤合在一起,缩短了一半时间(只用4天),铬化时间从14天缩短至4天。并获得了与Akmstrong氏改良法同样的效果。     

肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色方法的再改良

探讨肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色再改良的方法,以提高石蜡切片的诊断准确率。方法选择2010年6-12月在北京大学深圳医院行肾组织活检确诊为肾小球疾病的患者44例,其中IgA肾病20例,狼疮性肾炎12例,膜性肾病12例。对其肾组织除常规冰冻切片直接免疫荧光染色外,对石蜡切片进行高温、高压修复和胃蛋白酶消化处理,再分别行免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、补体(C3、C1q)、纤维蛋白(Fib)、HBsAg及HBcAg直接免疫荧光染色,比较石蜡与冰冻切片的直接免疫荧光染色结果。结果冰冻切片:肾小球数1～12个,平均5个;石蜡切片:肾小球数7～30个,平均15个。20例IgA肾病、12例狼疮性肾炎、12例膜性肾病患者的肾组织行冰冻(IgA、IgG、IgM、C3、C1q、Fib、HbcAg和HbsAg)直接免疫荧光染色时在不同荧光强度中所占比例与行石蜡直接免疫荧光染色比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论再改良的肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色是冰冻切片失败时较好的补救手段。其石蜡切片组织结构更清晰,免疫复合物沉积部位较冰冻切片更易判断。     

应用免疫胶体金技术对神经胶质瘤抗原作超微结构定位

用免疫胶体金技术在光镜和电镜水平对脑胶质瘤的抗原胶质微丝酸性蛋白(GFAP)、S-100蛋白进行定位。27例中GFAP全部阳性,26例S-100阳性。透射电镜下两种抗原的阳性金颗粒均在胶质微丝上,而S-100也可存在(?)细胞核中。表明应用适当固定液,用Eppon812包埋,可对肿瘤标本进行免疫电镜的研究。     

甲基绿-派洛宁-马休黄组合染色法检测神经元凋亡

目的 :提供一种研究神经元凋亡的形态学方法。方法 :应用甲基绿 -派洛宁 -马休黄组合染色法 ,检测沙土鼠脑缺血后海马神经元的凋亡。结果及结论 :甲基绿 -派洛宁 -马休黄组合染色法能显示细胞质mRNA明显增高时期的凋亡神经元。     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应（PCR）产物的微孔酶免疫方法,方法 对PCR所用2条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强,加样量38nL时即可显色,模板DNA经过10^11倍稀释后仍为阳性结果,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125uL,1.25uL及10^7,10^4稀释度,对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%,二敏感性均高于琼脂微电泳,结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

应用定量计数法评价新型隐球菌性脑膜炎的治疗效果

目的：探讨隐球菌定量计数法在判断两性霉素B(AMB)治疗新型隐球菌性脑膜炎的临床意义。方法：采用AMB治疗前后计数定量脑脊液(CSF)中的隐球菌数。结果：通过计数定量脑脊液中的隐球菌数，从AMB的开始治疗前数为102个／全片至患者愈数为0个／全片，直观地看出治疗效果。结论：隐球菌定量计数法是一种比较直观、快速、有效的实验室方法，实验室所提供的数据，能很好地协助临床诊断和指导临床用药。     

有机硅改性环氧树脂在油墨中的应用

以Ph2SiCl2、Me2SiCl2、MeSiCl3为原料合成了分子量为2000左右含端羟基聚苯基甲基硅氧烷。以该硅树脂与E-20环氧树脂共缩聚制备的有机硅改性环氧树脂作为油墨连结料，与TiO2、增塑剂、溶剂等制成A组分，固化荆为B组分，由A、B组分所组成的油墨具有优良的移印、成膜性能。研究表明该油墨具有较高附着力，固化膜具有耐热、耐寒、耐溶剂和高电绝缘等优点，可作为在苛刻使用条件下移印和丝印的特种油墨。     

一种快速红细胞活体染色法鉴别血尿来源

目的 提高血尿诊断的准确性,减少病人的创伤性痛苦。方法 利用一种快速红细胞染色法,在普通光学显微镜下对６０例血尿标本进行红细胞形态分型,鉴别血尿来源。结果 以临床确诊为肾小球肾炎为标准,以尿中畸形红细胞≥８０００个／ｍｌ为肾小球肾炎诊断依据,其敏感性为１００％,特异性为９４．６％。结论 该染色法操作简便、快速,易掌握。普通光学显微镜下背景清晰,畸形红细胞易辨认,与白细胞易区分,可代替相差显微镜鉴别     

新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测

目的:测定不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性.方法:30℃和37℃下用含有偶氮白蛋白的琼脂培养板培养不同来源及血清型的36株新生隐球菌菌株,测量其产生的廓清晕环的大小,计算CH值[菌落半径/(菌落半径 廓清晕环半径)]来比较其胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性强弱;用丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂观察两种酶活性改变;酶谱法观察菌株浓缩上清液中胞外蛋白水解酶活性和相对分子质量.结果:36株菌株在30℃和37℃培养条件下它们的平均CH值分别为0.558±0.170和0.575±0.169,两者间无显著差异;血清A(n=13)、B(n=13)、D/AD(n=6)型菌株各自的平均CH值分别为0.564±0.144、0.515±0.078和0.482±0.072,各组间无显著差异;临床分离株(n=23)、环境分离株(n=9)和荚膜缺陷株(n=4)各自的平均CH值分别为0.570±0.177、0.513±0.069和0.942±0.075(P＜0.05).对照组(不含抑肽酶)和抑肽酶不同浓度组(1.2、1.6 mU)的平均CH值分别为0.459±0.188, 0.975±0.287、0.733±0.252(P＜0.01).菌株浓缩液中含有复杂的胞外蛋白酶类成分.结论:新生隐球菌胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性在30℃、37℃下无显著差异;在临床分离株中比环境分离株和荚膜缺陷株强;在不同血清型菌株间无显著差别;可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制.