抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

血管内皮生长因子在肝癌中的表达

血管内皮生长因子(VEGF)是一种广泛存在于机体组织细胞的细胞因子,几乎参与体内各种疾病过程,是目前已知的最重要、最直接的血管生长因子。而肿瘤的生长、转移和复发要依赖于新生血管的形成,VEGF对肿瘤的血管生成起到关键作用。笔者就VEGF在肝癌中的表达及与肝癌的发生、转移、复发、预后及治疗等方面予以综述。1 VEGF的组织来源1983年,Senger从癌性腹水和肿瘤细胞培养介质中发现VEGF,当时称为血管通透因子(VPF);1989年,Ferrara等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出一种糖类蛋白质[1]。研究证明两者是同一蛋白质。它是内…     

RNA干扰真核表达载体pEGFP-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究

目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pEGFP- H1和pEGFP- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pEGFP- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pEGFP -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pEGFP- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论　pEGFP H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

斑蝥酸钠对人肝癌细胞HepG2的增殖作用及血管内皮生长因子表达的影响

目的研究斑蝥酸钠对人肝癌细胞的增殖作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)的表达的影响,探讨斑蝥酸钠抗肿瘤的作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株(HepG2),用不同浓度的斑蝥酸钠作用于肝癌细胞,采用MTT法观察不同浓度和作用时间下斑蝥酸钠对细胞增殖的影响,采用免疫组化法检测血管内皮生长因子的表达情况。结果在一定浓度范围内斑蝥酸钠对肝癌细胞有明显增殖抑制作用,且降低了VEGF的分泌水平,并呈时间-剂量依赖关系。结论斑蝥酸钠对肝癌细胞的增殖有抑制作用,且减低了细胞内血管内皮生长因子蛋白的表达,表明斑蝥酸钠在抑制肝癌生长的作用机制之一是通过抑制肿瘤血管生成发挥作用的。     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

血管内皮生长因子C mRNA在人乳腺癌细胞株中的表达

目的 :检测血管内皮生长因子C(VEGF C)mRNA在人乳腺癌细胞株MDA MB 2 31及MCF 7中的定位、定量表达。方法 :根据VEGF C基因序列 ,设计合成地高辛标记的特异性寡核苷酸探针 ,运用原位杂交方法检测培养的细胞株MDA MB 2 31及MCF 7中VEGF CmRNA的定位表达 ;并运用半定量RT PCR方法检测了两种细胞中VEGF C相对于看家基因 β 肌动蛋白 (β actin)的表达水平。结果 :原位杂交检测到MDA MB 2 31及MCF 7细胞的胞浆中有阳性蓝色颗粒 ,而阴性对照细胞的胞浆中则均无阳性颗粒 ;半定量RT PCR检测到两种细胞中VEGF C基因均以较高水平表达 ,相对 β actin的表达水平分别为 0 .89和 0 .6 8。结论 :人乳腺癌细胞株MDA MB 2 31及MCF 7细胞能够以较高水平转录VEGF CmRNA     

RNA干扰血管内皮生长因子受体表达对人肺腺癌细胞的抑制作用

目的:观察人血管内皮生长因子受体(VEGFR)RNA干扰重组腺病毒(Ad-VEGFRshRNA)对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:制备携带人VEGFR的RNA干扰重组腺病毒,转染A549细胞,通过荧光显微镜观察转染效率.应用Western印迹法检测A549细胞VEGFR蛋白的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,细胞周期及集落形成试验测定细胞生长抑制情况.同时,制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:Western印迹法显示RNA干扰组VEGFR表达水平明显降低;细胞生长曲线表明,RNA干扰后细胞生长明显减缓;细胞周期及集落形成试验提示RNA干扰后肿瘤细胞生长受到明显抑制.裸鼠皮下移植瘤生长情况提示RNA干扰可以显著抑制肿瘤生长.结论:RNA干扰重组腺病毒Ad-VEGFRshRNA能有效抑制A549细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

塞来昔布对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用

目的研究环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用.方法用MTr比色法观察其对肝癌细胞生长的影响;荧光显微镜和透射电子显微镜检测细胞凋亡,TUNEL染色法记数细胞凋亡指数,流式细胞仪定量分析.结果塞来昔布以剂量依赖的方式抑制SMMC-7721细胞的生长,2、10、20及40mmol/L塞来昔布对肝癌细胞的生长抑制率分别为20.78%、33.37%、48.57%和64.96%(P＜0.01).荧光显微镜和透射电镜观察到细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成等凋亡形态学改变.流式细胞仪定量分析示2、10、20及40mmol/L浓度下细胞凋亡率分别为(7.44±0.34)%、(19.59±1.73)%、(29.04±4.18)%和(42.14±2.40)%,与对照组(2.13±0.17)%比较均有显著性差异.结论塞来昔布能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖,亦能诱导其凋亡;诱导肿瘤细胞凋亡可能是塞来昔布抑制人肝癌细胞生长的机制.     

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用

目的构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF165）真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用. 方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165 mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标. 结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强. 与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%). 瘤细胞接种裸鼠后33 d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351±638) mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

LETM1在肝癌中的表达及其对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨亮氨酸拉链EF-hand结构域跨膜蛋白1(leucine bnzipper/EF-hand-containing transmembrane proteinl,LETMl)在肝癌组织中的表达水平及通过RNAi技术靶向LETM1基因对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖及凋亡的影响.方法 采用免疫组织化学方法、Western blot检测重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2012年9月至2013年4月共60例肝癌组织及其癌旁肝组织中LETM1蛋白表达情况.Western blot检测人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2及人正常肝细胞株LO2中的LETM1蛋白表达情况.将LETM1 siRNA经Lipofectamine 2000TM脂质体转染SMMC-7721(实验组为si-LETM1、对照组为si-NC),实时荧光定量PCR及Western blot分别检测LETM1转染后肝癌SMMC-7721细胞株中LETM1 mRNA及蛋白的表达.CKK-8及流式细胞术检测LETM1低表达对肝癌细胞增殖及细胞凋亡的影响.结果 ①免疫组织化学结果显示,LETM1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为73.33％(44/60),明显高于癌旁组织中的表达率28.33％(17/60,P＜0.01);Western blot检测结果显示,LETM1蛋白在肝癌组织中的表达相对量(2.335±0.221)较癌旁组织(1.386±0.081)明显增高(P＜0.01).②LETM1蛋白表达与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关(P＜0.05),而与肝癌患者性别、年龄、甲胎蛋白、HBsAg、Edmondson分级及TNM分期无关(P＞0.05).③LETM1蛋白在SMMC-7721及HepG2中的表达相对量[(分别为(1.447±0.149)、(1.190 ±0.113)]均明显高于LO2[(0.918 ±0.027),P＜0.05].④si-LETM1组与si-NC组和空白组比较,si-LETM1组细胞的增殖受到抑制(P＜0.01),尤以72 h及96 h最为显著;si-LETM1早期细胞凋亡数(14.6±2.3)％与si-NC早期细胞的凋亡数(6.3±0.7)％比较,差异有统计学意义(P=0.04).结论 LETM1蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织;基因沉默LETM1后的肝癌细胞其增殖能力明显减弱,凋亡能力明显增强.     

肝细胞生长因子体外抑制SMMC-7721人肝细胞癌细胞生长

目的 :观察肝细胞生长因子 (HGF)对体外培养的人肝细胞癌细胞的生长效应。方法 :将处于指数生长期的SMMC 772 1细胞经过 (HGF处理组 )或不经 (对照组 )HGF处理培养 1～ 4d ,采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞数 ,并进行细胞周期分析。结果 :HGF对SMMC 772 1细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用。在实验浓度内 ,使用最高浓度的HGF(rhHGF为 2 0 μg·L-1、cHGF为 10 0mg·L-1)对细胞增殖抑制作用最强。使用不同浓度 (5、10、2 0 μg·L-1)rhHGF处理 3d的培养细胞均有一半以上停留在G0 /G1期。结论 :HGF对SMMC 772 1人肝细胞癌细胞的体外生长有强烈的抑制作用 ,这与细胞生长阻滞在G0 /G1期有关。     

癌组织VEGF表达与原发性肝细胞癌进展的关系研究

目的 探讨血管生成与原发性肝细胞癌进展的关系。方法 收集1993年～2000年41例病人的手术切除病理证实与原发性肝细胞癌的标本，行免疫组化染色（SABC法）检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达以及肿瘤组织和肿瘤旁组织的微血管密度（MVD）。其中男34例，女7例；年龄35～65岁，平均48．8岁；肿瘤直径≤5cm者13例，〉5cm者28例，有包膜者19例，无包膜者22例。细胞学分级：Ⅰ级8例，Ⅱ级18例，Ⅲ级11例。Ⅳ级4例。门静脉或（和）肝静脉有癌栓形成者7例，无癌栓者34例。HbsAg或HBcAb阳性者33例，阴性者8例。结果 VEGF表达阳性率为70．7％（29／41）。VEGF的表达与MVD呈显著正相关（P〈0．01）。VEGF的阳性表达率与肿瘤病灶大小、有无静脉癌栓呈显著相关，肿瘤直径大、病期晚者表达率显著增高（P〈0．05或0．01）。有包膜的肿瘤VEGF表达率显著低于无包膜者。VEGF的表达与细胞学分级和是否有肝炎病毒感染无显著性相关。结论 肝细胞癌中VEGF的分泌增多可导致微血管数目增加，促进了其进展和转移。肿瘤较大、分期较晚的病例血管生成活性高，提示预后较差。     

血管生成素及受体和VEGF在人肝细胞癌组织中的表达及作用

目的 研究血管生成素及受体Tie-2、血管内皮生长因子(VEGF)在肝细胞癌血管生成和进展中的作用。方法 用RT-PCR和免疫组织化学方法分析了28例肝细胞癌、10例肝硬化和10例正常肝标本。探讨血管生成素及受体、VEGF的表达和HCC肿瘤血管生成和临床病理的关系。结果 Ang-2／Tie2、VEGF在肝细胞癌中表达明显上调，免疫组织化学也显示Ang-2和VEGF蛋白在肝癌表达增强。Ang-2／Ang-1mRNA比值与肿瘤血管侵犯及CD34染色的微血管密度相关。结论 Ang／Tie-2、VEGF在HCC肿瘤血管生成和进展中起重要作用。     

pEGFP-N2-ECM1重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的构建细胞外基质蛋白-1(ECM1)稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞系。方法应用PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N2-ECM1真核表达载体,经酶切、测序鉴定正确后,用脂质体转染SMMC-7721细胞,G418药物筛选稳定转染的细胞系。荧光显微镜检测融合蛋白表达,RT-PCR技术检测ECM1基因表达。结果构建的重组质粒经双酶切及测序分析鉴定,结果证实pEGFP-N2-ECM1构建成功;筛选获得稳定表达ECM1的SMMC-7721细胞。结论成功构建了pEGFP-N2-ECM1的真核表达载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中稳定表达,为研究ECM1在肝癌进展中的作用奠定了实验基础。     

槲皮素对人肾癌细胞株细胞增殖、侵袭及其VEGF表达的影响

目的研究槲皮素对人肾癌细胞株(ACHN)细胞增殖、侵袭力的影响,并探讨其可能机制。方法体外培养ACHN细胞,加入不同浓度的槲皮素进行处理后,用MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率,采用涂有Matrigel胶的Tr-answell小室模型对传代培养的ACHN细胞进行体外侵袭检测,以Western blot法检测ACHN细胞内血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果不同浓度的槲皮素均能抑制ACHN细胞的增殖,并有明显的浓度和时间依赖性(P<0.05);Tr-answell试验结果显示,与空白对照组比较,槲皮素处理组肾癌细胞侵袭能力明显下降;槲皮素处理组VEGF蛋白表达水平均明显低于空白对照组,且呈浓度依赖性。结论槲皮素可明显抑制ACHN细胞的增殖、侵袭力,其机制可能与下调VEGF表达有关。     

Effects of shRNA Targeting VEGF on VEGF mRNA Expression in Gastric Cancer Cells

In order to investigate the inhibitory effect of plasmid-mediated short hairpin RNA tar-geting vascular endothelial growth factor (VEGF) on the expression of VEGF mRNA in human gas-tric cancer cells, a plasmid vector for transcribing specific short hairpin RNA targeting VEGF ( pU6-VEGF ) was constructed, and then transfected into human gastric cancer cells using Lipofec-tamine2000. The VEGF mRNA expression level was detected by RT-PCR. RPMI1640 was used for blank control, and pSilencer 1.0-U6 empty plasmid for the negative control. Results showed the clone and sequence analysis revealed that the recombinant plasmid vector of pU6-VEGF was successfully constructed. The VEGF mRNA expression levels in blank control group, experimental group (pU6-VEGF) and negative control group (pSilencer1.0-U6) were 100%, 49% and 94%, respectively, indicating VEGF mRNA expression in the cells transfected with pU-VEGF vector was inhibited sig-nificantly as compared with blank control group and negative control group. It was concluded that the short hairpin RNA could significantly inhibit the expression of VEGF mRNA, which provided an experimental basis for treating human cancer with anti-angiogenesis.