人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的:自行构建人血小板源性生长因子B(PDGF-B)真核表达载体,为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法:实验于2002-01/2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据Genbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列,设计合成一对附加BamHⅠ,XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段,将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。③经测序鉴定后,再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因,构建了基因重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究,在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的：克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体，为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法：实验于2001-09／2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA，经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列，将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定，然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165 cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果：反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段，酶切pMD18-T-hVEGF-65得一与目的片段大小一致的条带，且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论：成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体，如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达，有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及鉴定

目的：构建及鉴定胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区（mIA-2i）和IgG Fc嵌合蛋白的真核表达载体pEGFP-N2／mIA-2i-mIgGFc。 方法：实验于2004-09／2005-07在南京医科大学病原生物学系完成。①采用反转录一聚合酶链反应方法从ICR小鼠的脑组织和脾脏中分别扩增胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区（mIA-2i）和IgG Fc段（mIgG Fc），并引入相应的酶切位点（XhoⅠ／BamH Ⅰ和BmH Ⅰ／EcoRⅠ）。②分别将扩增后的片段克隆入pUCm-T质粒，通过XhoⅠ／BamHⅠ双酶切和连接后，获得pUCm-T／mIA-2i-mIgG Fc重组质粒。③经过XhoⅠ／EcoRⅠ双酶切后，将融合基因mIA-2i-mIgG Fc克隆入真核表达载体pEGFP-N2。通过酶切、聚合酶链反应及插入片段序列测定对重组质粒pEGFP-N2／mIA-2i-mIgG Fc进行鉴定。 结果：①从ICR鼠的脑组织和脾脏中反转录-聚合酶链反应获得胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区和IgG Fc段。②通过基因工程操作，获得重组克隆质粒pUCm-T／mIA-2i和pUCm-T／mIgG Fc，并经酶切鉴定克隆成功。③获得重组克隆质粒pUCm-T／mIA-2i-mIgG Fc，经聚合酶链反应和双位点酶切鉴定重组成功。④获得重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgG Fc和pEGFP-N2/mIA-2i，经聚合酶链反应、酶切及测序鉴定证实特异性片断插入真核表达载体成功。 结论：pEGFP-N2／mIA-2i-mIgG Fc真核表达载体的构建．为利用胰岛细胞瘤相关蛋白2基因疫苗预防非肥胖性糖尿病小鼠发生自身免疫性糖尿病的研究奠定了基础。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的：构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒，为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军第三О二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP—C1-hTERT，筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①聚合酶链反应扩增目的基因：电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3．5kb处有特异性目的条带，绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建和鉴定结果：双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果：荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论：①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建成功，为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法，并为建立永生化人肝细胞系奠定基础．     

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的:克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体,为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法:实验于2001-09/2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA,经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定,然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段,酶切pMD18-T-hVEGF165得一与目的片段大小一致的条带,且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论:成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体,如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达,有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。     

小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段，构建pSecTag2／Hygrn B—Wnt3a真核表达载体，观察其在cos-7细胞中的表达，为基因治疗脊髓损伤提供实验依据。方法：实验于2004-09／2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成。选取清洁级孕13．5d的KM小鼠1只，脱颈处死，冰冷条件下迅速取出胚鼠，解剖显微镜下剥离胚脑，在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA。利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段，将该基因片段克隆入T载体，聚合酶链反应法筛选并测序，双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a。转染并筛选稳定表达的COS-7细胞，Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达。结果：①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA：自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后，凝胶电泳可见约1．1kh的特异性扩增片段，与预期获得产物大小相符。②pMD18-T／Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序：测序报告所克隆的Wnt-3a为1058bp．通过Blast同源性分析，与GeneBank收录的序列一致，克隆小鼠Wnt-3a基因获得成功。③真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的双酶切及测序：随机挑选10个克隆，聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个。经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达：脂质体转染cos-7后48h，Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达，转染pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的COS-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带，而培养上清中未能检测到蛋白的表达。结论：小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a构建成功，转染COS-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白。     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的：应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体，研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达，探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法：实验于2003-12／2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvspla—enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA—vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA—ires中，构建重组质粒PcDNA—enos—ires-lvegf，经酶切，聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后，转染人脐静脉内皮细胞，硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性，免疫组化和荧光双标记及western blotting检测转染后细胞蛋白水平的表达，Trizol提取总RNA，反转录一聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果：成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30％-40％。结论：双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf的成功构建和双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中表达为研究内皮型一氧化氮合酶在血管结构与功能上所起上所起的作用奠定了基础。