老年大鼠骨缺损的骨形态发生蛋白-2的基因治疗

目的 通过组织工程和基因工程结合的方法从种子细胞、生长因子、细胞支架三方面满足老年机体骨修复的需要，为这些方法在老年机体的应用提供参考。方法 体外分离、扩增、骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因修饰MSCs，检测细胞上清液中BMP2的表达；通过检测成骨细胞标志性蛋白如碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL Ⅰ-α1）、骨涎蛋白（BSP）、骨桥素（OPN）的表达观察老年大鼠MSCs的成骨分化能力；检测BMP2基因修饰的MSCs与磷酸三钙（TCP）复合物在裸鼠体内的异位成骨能力；将BMP2基因修饰的MSCs／TCP植入老年大鼠骨缺损部位，修复自体股骨6mm节段性骨缺损。结果 BMP2基因修饰的MSCs可以有效分泌BMP2，诱导后第7天有ALP、COLⅠ-α1、OPN、BSP的明显表达，并可诱导裸鼠体内异位成骨。放射学及组织学检测证明BMP2转染的MSCs与TCP载体复合后可成功修复老年大鼠股骨节段性缺损。结论 BMP2基因修饰的老年MSCs可以恢复成骨分化能力，在体内可以成功修复老年大鼠股骨节段性骨缺损，组织工程和基因工程方法可能成为治疗老年性骨骼疾病的新途径。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

骨形态发生蛋白9介导的成骨及其调控研究进展

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族成员之一,在骨骼发育、骨形成和干细胞分化中起着至关重要的作用。目前研究表明,BMP9具有特殊的蝴蝶样构型的半胱氨酸支架结构;在BMP家族中,BMP9是体内和体外诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs））成骨分化能力最强的蛋白;较传统BMP而言,BMP9具有更特殊的调控因子和更复杂的串扰机制;在修复骨缺损、促进脊柱融合方面,BMP9也显示出良好的骨再生能力。本文就BMP9结构特点、成骨作用、调控机制及其临床应用前景作一综述。     

转染骨形态发生蛋白-2基因的人骨髓间质干细胞复合异种骨支架异位成骨的效果

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)罐因转染的人骨髓间质干细胞复合异种骨支架异位成骨效果。方法 分组：(1)BMP-2基因转染细胞 异种骨支架[去抗原牛松质骨(BCB)]；(2)对照基因转染细胞 BCB；(3)未转染细胞 重组BMP-2 BCB；(4)未转染细胞 BCB；(5)BCB。分别将各组人工骨植入裸鼠皮下，于术后4，8周行组织学观察．结果 体内植入后3d，细胞持续表达外源基因BMP-2基因转染组8周时完全由新形成的编织骨构成，血管丰富。结论 BMP-2基因转染后细胞复合BCB支架，可以在异位形成骨组织并诱导毛细血管长入。     

转基因骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复兔桡骨缺损

目的：探讨以复制缺陷重组腺病毒介导人骨形态发生蛋白(BMP)-2转基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)复合纤维蛋白凝胶来修复节段性骨缺损的可行性。方法：于14只日本大耳白兔双侧桡骨中段造成10mm骨缺损，采用四种方法进行处理：A组植入转基因MSCs与纤维蛋白凝胶的复合物；B组植入单纯MSCs与纤维蛋白凝胶的复合物；C组植入纤维蛋白；D组不做处理，留作空白对照。每组7条桡骨。术后12周进行组织学、放射学检查及生物力学检测。结果：A组缺损区在成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于B组，其骨缺损得到了较彻底的修复。C、D两组均不能产生骨性愈合。结论：转基因MSCs复合纤维蛋白凝胶修复节段性骨缺损可达到较好的效果。     

人骨形态发生蛋白2重组腺病毒在动物模型中活性观测

目的利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒,并进行体内表达,测定活性,为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法同源重组构建重组腺病毒,将30只SD大鼠随机分为治疗组和对照组,将纯化后的重组腺病毒50μl注入SD大鼠股部肌肉陷窝病损处,通过组织学染色、X线片对动物模型的组织变化进行观测。结果重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性,治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组。结论应用于动物实验中目的基因表达,并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗方面的一次尝试,且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功,也为我国骨科疾病的基因治疗进一步研究奠定了基础。     

骨形态发生蛋白复合物修复甲状软骨缺损的实验研究

目的：研究骨形态发生蛋白对喉软骨缺损的修复作用．方法：兔甲状软骨中部手术切除５ｍｍ×６ｍｍ全层软骨作为喉软骨缺损的动物模型，采用骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）与陶瓷化骨颗粒复合作修复材料，动态观察缺损区修复情况．结果：２周时缺损区内已有软骨基质形成，４周时软骨断端形成管状骨，１６周时缺损区已全部被新生骨组织充填．而对照组仅有少量的软骨生成．结论：ＢＭＰ复合物可在甲状软骨缺损区内较快地诱导软骨和骨形成，从而修复软骨缺损．     

地塞米松预培养兔BMSCs促进腺病毒介导BMP2转基因的高效表达

目前，骨形态发生蛋白2（BMP2）的基因治疗在骨组织工程中正成为广泛研究的热点。国外最新研究表明，以腺病毒为载体转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）表达BMP2的效率取决于细胞的分化状态，1μmol／L地塞米松诱导培养人BMSCs后再进行腺病毒转染，其BMP2的表达量是单纯转染组的20倍。在此基础上，笔者首次利用同时表达绿色荧光蛋白（GFP）和BMP2的AdCMV—hBMP2-IRES—GFP-1转染兔BMSCs，通过流式细胞仪等方法，     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

骨肉瘤侵袭骺板的MRI表现与BMP-2表达及其临床意义

目的:研究MR I显示骨肉瘤侵袭骺板的价值,为指导治疗提供依据;并探讨BMP-2在骨肉瘤侵袭中的作用。方法:回顾分析15例经病理证实的骨肉瘤患者术前X线及MR I图像,男10例,女5例,平均年龄(14.0±1.2)岁。股骨下端10例,胫骨上端5例。结果:本组所有患者骺板未闭合,与病理组织学所见比较,发现MR诊断骨肉瘤侵袭骨骺的准确率为100%;BMP-2在瘤体、骺板浸润区、正常骺板、瘤周正常组织的阳性表达率分别为93.33%(14/15)、86.66%(13/15)、13.33%(2/15)、20.00%(3/15),瘤体、骺板浸润区与正常骺板、瘤周正常组织之间差异有显著意义(P<0.01)。结论:BMP-2与骨肉瘤侵袭骺板具有一定的关系;MR I显示骨肉瘤对骺板的侵犯评估优于X线平片,可指导治疗方案的选择,尤其在考虑保肢手术时有较高的价值。     

骨形成蛋白与磷酸钙复合材料对椎体骨缺损的修复作用

 目的 探讨骨形成蛋白(BMP)与磷酸钙骨水泥(CPC) 复合材料在椎体骨缺损的修复能力及其作为椎体成形术的生物活性灌注剂可能性.方法 将CPC作为BMP的载体复合成为CPC/BMP生物活性人工骨材料.在16只羊腰1～ 3椎体侧前方制成约1 cm×1 cm×1 cm的骨缺损,分别植入CPC/MBP生物活性人工骨材料和CPC.术后3、6个月行X线、组织学检查和电镜扫描.观察新骨形成和材料降解情况.[ HTH〗结果 术后所有的动物成活.CPC/BMP植入3个月时植入材料与受区骨间出现软骨细胞向成骨分化,新骨组织长入材料并与材料紧密结合.6个月时新骨多为板层骨,植入材料范围缩小,材料大量溶解,出现较大的空隙.BMP与CPC复合有效地促进了新骨的形成和新骨的钙化,同时也加速CPC材料的降解.而CPC材料降解速度缓慢,新骨形成量少,仅在材料的表面.结论 CPC是BMP理想的载体,CPC/BMP生物活性人工骨材料椎体骨缺损有较强的修复能力,可作为椎体成形术的生物活性灌注剂.     

组织工程软骨移植物修复兔关节软骨缺损

目的　观察组织工程软骨移植物修复兔关节软骨缺损的效果。　方法　经软骨起源诱导后的兔骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),与牛Ⅰ型胶原及人纤维蛋白相混合制成组织工程软骨移植物。60只5个月龄的日本大耳白兔均分为软骨移植物组、单纯载体对照组和空白对照组,观察各组修复兔股骨髁关节软骨全层缺损的效果。　结果　软骨移植物组12周时已形成正常厚度的软骨层及完整的软骨下骨板,O'drilscoll组织学评分18.22±2.45,Ⅱ型胶原含量97.9%,甲苯胺蓝变色反应表明其与周围正常软骨无明显区别,为透明软骨组织修复。而对照组12周时为纤维软骨修复,后期为纤维组织和板层骨修复。　结论　该组织工程软骨移植物作为软骨移植的替代物是可行的。     

多孔聚乳酸-聚乙醇酸共聚物作为缓释重组人骨形态发生蛋白-2载体的实验研究

目的 探讨多孔聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)作为重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的载体，通过体外释放试验和体内活性试验来评价rhBMP-2释放的动力学过程及活性。方法 采用乳液冷冻干燥法制作含rhBMP-2缓释系统的PLGA支架，支架进行扫描电镜观察；采用高效液相色谱分析仪检测不同时间点释放液中rhBMP-2的含量，进行累积释放量的动态观察；将缓释rhBMP-2支架植入SD大鼠大腿股部肌袋内，分别在不同时间点进行组织学观察。结果 支架材料的形态学观察显示，材料表面呈多孔状；rhBMP-2从支架中释放的动力学过程为第1天表现为爆发性释放(30.0％)，以后缓慢持续释放，至1个月左右释放量达80.6％；活性评价结果显示，rhBMP-2缓释支架组可见新生骨组织形成伴较多的骨母细胞排列，无rhBMP-2支架组则无成骨现象。结论 多孔PLGA可作为rhBMP-2的缓释载体，并具有良好的生物活性，可作为骨组织工程研究中的新型支架，同时具有临床应用的可行性。     

血管内皮生长因子在骨形态发生蛋白-2诱导成骨细胞过程中的作用

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨过程中的作用。方法（1）取小鼠胚胎成骨细胞进行体外培养，RT—PCR法检测rhBMP-2（300ng／m1）诱导成骨细胞分化过程中VEGF受体（VEGF receptors，VEGF—R）的表达。（2）采用VEGF反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODNs）和苏拉明分别阻断VEGF的合成及功能，观察对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和钙结节形成的影响。（3）在rhBMP-2诱导成骨的同时，添加不同浓度的外源性VEGF，观察对成骨细胞体外矿化能力的影响。结果（1）VEGF—R（Flk-1和Flt-1）mRNA在成骨细胞呈稳定弱表达，rhBMP-2干预24h后VEGF—R的表达量无明显变化。（2）应用VEGF ASODNs和苏拉明可抑制rhBMP-2所诱导的ALP活性和钙结节形成，并存在剂量依赖效应。（3）单独应用VEGF并不能使成骨细胞分化为钙结节，外源性VEGF的加入亦不影响rhBMP-2刺激钙结节形成的能力。结论VEGF在成骨细胞可以自分泌的形式发挥作用，VEGF至少部分参与了rhBMP-2的诱导成骨活性。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,增强VSMC中gax基因的表达。方法　采用位置特异性重组方法构建携带大鼠 gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体(AdCMV gax) ,经 2 93细胞扩增 ,纯化制备高滴度病毒转染液 ;以病毒转染液常规转染VSMC后 ,应用RT PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中 gaxmRNA和蛋白质的表达。 结果　流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV gax转染VSMC后 ,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高 ,转染后 2 4小时即可达 80 %左右 ,高水平的表达可维持 5天以上 ;AdCMV gax转染前 ,PDGF BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用 ,AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中 gax基因的表达均比转染前显著增高。 结论　腺病毒载体可有效地介导 gax基因转染VSMC ,并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究 gax基因对VSMC生物学行为的影响     

模拟失重条件下骨形态发生蛋白-2诱导的成骨细胞蛋白激酶MEK1活性的变化

目的观察模拟失重条件下由骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞（ROS17／2．8）中丝裂原激活的蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（MAPK／ERK kinase1，MEK1）活性的变化。方法在地面1G和回转器模拟失重条件下培养ROS17／2．8细胞，培养时间分别为24h、48h和72h。培养结束前1h加入BMP-2（500ng／ml），1h后提取细胞蛋白，应用Western Blotting法检测细胞中的总细胞外信号调节激酶1／2（总ERK1／2）和磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK1／2）的含量。另设一空白对照组，即1G条件下不加BMP-2的培养组。结果7个实验组细胞的总ERK1／2蛋白表达量无明显差异；空白对照组p-ERK1／2的表达量极低，明显低于其他6组（P〈0．01）；各时间点模拟失重组p-ERK1／2表达量均低于1G对照组（P〈0．01）；随着失重时间延长p-ERK1／2表达量呈逐渐降低的趋势（P〈0．01）。结论模拟失重条件下BMP-2诱导的成骨细胞MAPK信号通路中蛋白激酶MEK1的活性下降。     

重组人BMP-2聚乳酸缓释纳米微球对体外培养兔成骨细胞增殖和矿化的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-2聚乳酸纳米微球缓释系统(rhBMP-2-PLA-Ns)对体外培养的兔成骨细胞的生物学效应. 方法 体外培养兔成骨细胞并鉴定,将rhBMP-2-PLA-Ns和第3代成骨细胞一起培养,免疫荧光法检测成骨细胞核中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,茜素红染色方法观察矿化结节的形成,Western blot检测rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞自分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用,并与单纯rhBMP-2组和空白组进行比较. 结果 培养5 d后,各组PCNA阳性细胞差异无统计学意义.培养10 d后,rhBMP-2-PLA-Ns组阳性细胞数明显高于单纯rhBMP-2组和空白组,表明rhBMP-PLA-Ns能够明显促进PCNA在成骨细胞核中的表达.与其他两组比较,rhBMP-2-PLA-Ns能显著促进矿化结节的形成(P<0.05);对Western blot检测结果进行半定量分析显示:三组成骨细胞均有VEGF的自分泌,加入rhBMP-2-PLA-Ns成骨细胞自分泌VEGF的量超过单纯rhBMP-2组以及空白对照组(P<0.05).结论 rhBMP-PLA-Ns有较好的生物学活性,能促进成骨细胞的增殖、矿化和VEGF自分泌的增加,具有一定的临床应用价值,为加快骨创伤的愈合提供了新的思路.