以HIF2α为靶点的化合物筛选的细胞模型构建

目的 建立稳定表达血管内皮生长因子A（VEGFA）启动子区5×缺氧反应元件（5×HRE）和萤光素酶（Luc）报告基因的人肾透明细胞癌（786-O）单克隆细胞系,构建以缺氧诱导因子2α（HIF2α）为靶点的化合物筛选的细胞模型,并对其应用加以初步验证。方法 采用基因重组技术,构建含有VEGFA启动子区5×HRE以及Luc报告基因的慢病毒载体,并感染786-O细胞,经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的786-O-5×HRE-Luc细胞系;采用等浓度梯度稀释获得单克隆细胞系,运用HIF2α抑制剂PT2385和PT2399处理,检测Luc活性变化,筛选对PT2385和PT2399反应更灵敏的单克隆细胞系。结果 通过基因测序鉴定,VEGFA启动子区5×HRE和Luc报告基因慢病毒表达载体构建成功,经过嘌呤霉素（Puro）筛选获得稳定表达Luc的786-O-5×HRE-Luc细胞;PT2385和PT2399可剂量依赖性的降低细胞Luc的活性;得到对PT2385和PT2399反应灵敏的单克隆细胞系。结论 建立了786-O-5×HRE-Luc稳定表达5×HRE和Luc报告基因细胞系,为高通量筛选靶向HIF2α的药物提供一类新的细胞模型。     

MET扩增非小细胞肺癌患者的临床病理特征及其对克唑替尼的响应分析★

目的 探讨非小细胞肺癌患者MET基因扩增与临床病理特征的相关性，揭示MET扩增与其他驱动基因突变共存患者对克唑替尼的敏感性。方法 回顾性分析252例非小细胞肺癌患者的临床病理资料，采用二代测序法检测常见驱动基因EGFR、ALK、ROS1、RET、HER2、BRAF和MET的突变情况，特定突变患者采用Fish法进行验证；根据患者MET基因扩增情况进行分组，比较各组患者年龄、吸烟史、性别、病理类型、疾病阶段及其他驱动基因突变情况；收集MET扩增与其他驱动基因突变共存患者使用克唑替尼后的预后数据。结果 252例患者中，MET扩增发生率为19.4%（49/252），其中原发MET扩增和继发MET扩增突变率分别为16.2%（33/203）和31.2%（15/48）。MET扩增多见于Ⅲ~Ⅳ期肺癌（P=0.02）、骨转移（P=0.02）及ROS1融合阳性（P=0.02）患者，与年龄、性别、吸烟史、病理学分类无明显相关性（P>0.05）。31例MET扩增阳性患者具有其他驱动基因突变，其中5例患者使用克唑替尼进行治疗。5例使用克唑替尼的患者中，2例是原发MET扩增，3例是继发MET扩增；4例使用克唑替尼获得了较好的效果，1例死于重度感染。总结 MET扩增在本研究人群中的突变率高于文献报道，且多见于临床分期较晚、骨转移、ROS1融合阳性患者。MET扩增与其他驱动基因突变共存的患者也能在一定程度上从克唑替尼中获益。     

免疫应答基因与小鼠膜性肾小球肾炎发病的关系

目的 探讨免疫应答基因（I-Aβ1）与小鼠膜性肾小球肾炎发病之间的相关性.方法 复制小鼠膜性肾小球肾炎模型,提取实验组和对照组总RNA,通过RT-PCR体外扩增I-Aβ1基因,对扩增产物进行测序及分析.结果 实验组小鼠I-Aβ1基因突变率为2.578‰,对照组I-Aβ1基因突变率为0.286‰,实验组I-Aβ1基因突变率明显高于对照组（P＜0.01）.结论 I-Aβ1可能与小鼠膜性肾小球肾炎发病相关.     

沉默hnRNP A2/B1基因后通过Bcl-2/Bax影响宫颈癌CaSki细胞的凋亡

目的 探索沉默核内不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1）基因后对宫颈癌CaSki细胞的增殖、凋亡的 影响及其相关作用机制。方法 建立稳定沉默 hnRNP A2/B1 的 CaSki 细胞株,分为未沉默 hnRNP A2/B1 的空白组 （CaSki 组）、转染阴性序列的阴性对照组（CaSki-NC 组）、转染阳性 hnRNP A2/B1 干扰序列的实验组（CaSki-shRNA 组）。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及蛋白印迹法（Western blot）对各组细胞hnRNP A2/B1的mRNA及蛋白表达 水平进行验证,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖能力,细胞克隆实验检测各组细胞克隆形成能力,流式细 胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果 与CaSki组、 CaSki-NC相比较,CaSki-shRNA组细胞hnRNP A2/B1的mRNA及蛋白表达水平均明显减低,细胞的增殖能力在48 h 降低,克隆形成能力下降,凋亡率增加,Bcl-2蛋白的表达减低,Bax表达升高（P＜0.01）,而CaSki组与CaSki-NC组之 间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 沉默hnRNP A2/B1基因后能抑制宫颈癌CaSki细胞的增殖能力,且可能通过 Bcl-2/Bax影响宫颈癌CaSki细胞的凋亡。     

喉鳞癌中PTEN蛋白表达及临床意义

目的 探讨第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)蛋白在喉鳞癌组织中的表达及意义.方法 采用流式细胞术检测PTEN蛋白在60例喉鳞癌组织标本(A组)和30例正常喉黏膜组织标本(B组)中的表达;A组再分为有淋巴结转移组(A1组,12例)和无淋巴结转移组(A2组,48例).结果 A组PTEN蛋白表达明显低于B组(P＜0.01);临床Ⅰ+Ⅱ期喉鳞癌PTEN蛋白表达量高于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05);高中分化喉鳞癌PTEN蛋白表达高于低分化喉鳞癌(P＜0.05);A1组患者的PTEN蛋白表达量低于A2组(P＜0.01);喉鳞癌生存期大于5年的患者PTEN蛋白阳性表达率高于生存期小于5年的患者(P＜0.01).结论 PTEN蛋白可能是评价喉鳞癌预后的一个重要指标.     

软组织损伤患者心肌酶谱的变化研究

目的研究急性软组织伤患者血清心肌酶谱天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）、肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-Mb）等的表达量与软组织损伤程度的关系。方法选择软组织损伤的119例患者资料,对多发性与局部性两组患者的心肌酶谱变化情况进行分析。结果软组织伤患者心肌酶谱较正常对照组均有不同程度的升高,差异具有统计学意义（P〈0.05）;两组间各项指标的差异也具有统计学意义（P〈0.01）。结论软组织损伤患者心肌酶谱变化明显,变化量与损伤程度成正相关。     

新疆地区原发性肝癌肿瘤同时性转移基因差异表达

目的：研究新疆地区原发性肝癌肿瘤同时性转移原发灶和转移灶的基因差异表达。方法：选取新疆医科大学第一附属医院2018年1月 ~ 2021年5月收治的首次出现同时性转移的原发性肝癌患者21例，采用下一代测序技术（NGS）研究其原发灶和转移灶中突变基因的表达，以及所涉及的通路和药物作用靶点，分析其突变基因与临床特征的关系；并用Kaplan-Meier单因素生存分析统计患者基因突变与临床特征及总生存期间的相关性。结果：原发性肝癌标本中原发灶和转移灶共同显示出突变率最高的10种基因：MUC16（43%）、TTN（36%）、ZAN（29%）、MYO18B（29%）、DNAH7（29%）、DNAH10（29%）、DMLX2（29%）、DCC（29%）、CSMD1（29%）、CDLSR2（29%），转移灶和原发灶突变基因差异无统计学意义（P ＞ 0.05），且基因变异的分类主要为错义突变，以单核苷酸多态性（SNP）最多见。在碱基突变的统计中，C ＞ A替换发生率最高，C ＞ T替换的发生频率次之。原发性肝癌患者TTN基因突变与性别、族别、分化程度有关（P ＜ 0.05）；MYO18B基因突变与族别有关（P ＜ 0.05）；TTN基因突变是原发性肝癌患者预后的独立预测基因；共筛选出10个原发灶和转移灶中突变基因的共同药物作用靶点，分别为可成药基因组、丝氨酸/苏氨酸激酶、离子通道、肿瘤抑制因子、酪氨酸激酶、DNA修复因子、复杂转录因子、转录因子结合位点、肿瘤治疗靶点基因组、ABC转运体。结论：原发性肝癌同时性转移异质性不明显。本研究筛选出原发性肝癌少见基因突变、与临床预后相关的基因突变以及药物作用靶点和基因突变所涉及的通路，为原发性肝癌的诊断、潜在的治疗靶点及相关的分子机制研究提供参考。     

急性心肌梗死患者白介素10基因启动子-592C/A多态性分析

目的：对急性心肌梗死（AMI）患者白介素-10（IL-10）基因启动子-592C/A进行多态性分析,探讨AMI患者IL-10基因-592C/A单核苷酸多态性分布及其与AMI发病的相关性。方法采用DNA试剂盒提取170例AMI患者（AMI组）及153例排除冠心病患者（对照组）的外周静脉血DNA,经聚合酶链反应（PCR）扩增目的DNA片段后,用试剂盒回收PCR产物,测序鉴定IL-10基因启动子-592C/A多态性,并检测血糖和血脂等生化指标的变化。结果 IL-10基因启动子-592C/A在AMI组和对照组中均存在CC、AC和AA 3种基因型;两组患者3种基因型分布频率及A、C等位基因频率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）;经对多个危险因素的多元logistic回归分析显示,IL-10基因启动子-592C/A 3种基因型与AMI的发病不相关。结论 IL-10基因启动子-592C/A多态性可能与AMI的发病无明显关系。     

利用生物信息技术分析LncRNA SNHG4与成人软组织肉瘤患者预后的相关性

目的 使用公开数据研究LncRNA SNHG4与成人软组织肉瘤预后的相关性。方法 根据LncRNA SNHG4表达将成人软组织肉瘤患者分为高表达组和低表达组,比较两组人群临床特征分布差异、生存分析及COX回归分析;使用基因组富集分析进行功能分析。结果 成人软组织肉瘤中SNHG4表达分组中的残余肿瘤差异有统计学意义(P<0.01)。生存分析显示SNHG4高表达组比低表达组的总生存低(P=0.001)。单因素COX回归分析显示SNHG4表达与总生存正相关(P<0.001)。多因素COX回归分析显示SNHG4是成人软组织肉瘤总生存独立相关因素(P=0.006)。基因组富极分析表明,肌细胞生成、参与G2/M检查点、E2F转录因子的靶标、丝分裂纺锤体组装和被KRAS激活下调相关基因在SNHG4高表达组中富集。结论 LncRNA SNHG4是提示成人软组织肉瘤患者不良预后的潜在分子标志物。     

TEM-1型β-内酰胺酶及CarO蛋白介导的耐舒巴坦鲍曼不动杆菌临床株耐药机制研究

目的 研究 TEM-1 型 β-内酰胺酶及 CarO 蛋白介导的鲍曼不动杆菌临床株对舒巴坦的耐药机制。方法 将 24 株非重复鲍曼不动杆菌临床株通过琼脂稀释法分为舒巴坦非敏感组（18 株）和敏感组（6 株），用纸片扩散法（K-B）行药敏试验，PCR 扩增 blaTEM-1和 carO 基因，选取 4 株 blaTEM-1阳性菌株（A3、A5、1327、C1），对其扩增产物测序，BLAST 软件分析；应用实时荧光定量 RT-PCR 技术检测 2 组菌株 blaTEM-1和 carO 基因 mRNA 转录情况。结果敏感组临床株对美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林耐药率分别为 1/6、2/6、3/6、1/6、5/6、5/6；非敏感组分别为 6/18、10/18、18/18、18/18、18/18。敏感组未检出 blaTEM-1，非敏感组中 16 株临床株扩增出 blaTEM-1；24 株临床菌株全部扩增出 carO 基因。测序显示 4 株临床株 blaTEM-1基因均未出现有义突变；A3、A5、1327 启动序列为 P4，C1 为 P3。BlaTEM-1基因阳性菌株 mRNA 相对表达量与其对舒巴坦 MIC 值呈正相关（rs=0.551，P=0.027）；carO 基因 mRNA 相对表达在敏感组和非敏感组中无差异。结论 临床分离鲍曼不动杆菌受试菌株耐药严重，其对舒巴坦的耐药机制与 TEM-1 型 β-内酰胺酶高表达有关，而 blaTEM-1基因启动子调控可能是 TEM-1 型 β-内酰胺酶高表达的原因之一。     

食管鳞状细胞癌中Apaf-1基因启动子区甲基化状态及其与EZH2 蛋白表达的关系*

【摘要】目的 探讨食管鳞状细胞癌（ESCC）中凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）启动子区的甲基化状态及其与 EZH2 蛋白表达之间的相关性。方法 应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测128例食管鳞癌患者癌灶组织及相应癌旁组织的Apaf-1基因甲基化情况,应用免疫组织化学方法检测Apaf-1和EZH2的蛋白表达情况。结果 Apaf-1基因在食管鳞癌组织中的甲基化率为52.3%,显著高于癌旁正常组织的4.7%（P < 0.01）,不同肿瘤TNM分期患者的 Apaf-1基因甲基化率差异有统计学意义（P < 0.01）。食管鳞癌组织Apaf-1蛋白表达阳性率为41.4%,显著低于相应癌旁正常组织的94.5%（P < 0.01）。食管鳞癌组织EZH2蛋白表达阳性率为72.7%,显著高于相应癌旁正常组织的 12.5%（P < 0.01）,不同肿瘤TNM分期和组织分化程度患者的Apaf-1和EZH2蛋白阳性表达率差异有统计学意义（P < 0.01）。食管鳞癌中Apaf-1基因甲基化与其蛋白阳性表达率呈负相关(r=-0.722),Apaf-1与EZH2的蛋白表达呈明显的负相关(r=-0.232)。结论Apaf-1和EZH2可能共同参与了食管鳞癌的发生发展,Apaf-1基因启动子区的异常高甲基化可能是食管鳞癌中此基因失活的重要原因之一。     

老年急性髓系白血病患者临床特征与预后分析

目的 探讨老年急性髓系白血病（AML）的基因突变及预后因素。方法 选取医院血液科2015年1月至2020年12月收治的年龄≥60岁的AML患者183例，将其中86例接受化学药物治疗（简称化疗）的患者分为标准化疗组（12例）和低强度化疗组（74例）；采用实时荧光定量聚合酶链式反应和DNA测序技术对133例患者行基因突变检测。分析患者基因突变情况及预后影响因素。结果 患者的基因突变频率为88.72%(118/133)，突变频率排名前5的基因分别为WT1(60.90%)、NPM1(22.56%)、IDH2(12.78%)、DNMT3A(10.53%)、FLT3-ITD(9.77%)。多（≥2个）基因突变频率为46.62%(62/133)，常见的共存突变基因为WT1+NPM1(16.54%)、WT1+IDH2(9.02%)、WT1+FLT3-ITD(8.27%)、WT1+DNMT3A(7.52%)。WT1+FLT3-ITD及WT1+DNMT3A突变患者的中位生存期均显著短于WT1+NPM1突变患者（P <0.05）。低强度化疗组的完全缓解（CR）率和客观缓解（OR）率分别为49.02%和...     

C1236T、 G2677T/A 和C3435T 基因多态性与乳腺癌分子分型的关系及意义

摘要： 目的 观察多药耐药基因 1 （MDR1） 第 12、 21 及 26 外显子 C1236T、 G2677T/A 和 C3435T 基因多态性在乳腺癌患者外周血中的分布, 分析其与分子分型的关系。方法 应用高分辨熔解曲线 （HRM） 技术检测 400 例乳腺癌患者 C1236T、 G2677T/A 及 C3435T 基因多态性。采用 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验进行基因型分布遗传平衡吻合度检验。参照 2013 年 St.Gallen 国际专家乳腺癌分子分型共识。分析乳腺癌患者中 C1236T、 G2677T/A 和 C3435T 基因型分布特点, 并探讨其与分子分型的关系。结果 （1）400 例乳腺癌患者中 C1236T、 G2677T/A 和 C3435T 中分别有 2 例、 3 例和 2 例标本未得出基因分型结果, C1236T 位点 CC、 CT 和 TT 基因型分别占 16.08% （64/398）、 44.22% （176/398） 和 39.70% （158/398）; G2677T/A 位点 GG、 GT、 GA、 TT 和 AT 基因型分别占 16.62% （66/397）、 44.33% （176/ 397）、 7.05% （28/397）、 27.46% （109/397） 和 4.54% （18/397）; C3435T 位点 CC、 CT 和 TT 基因型分别占 21.11% （84/ 398）、 56.03% （223/398） 和 22.86% （91/398）。经 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验, 认为 C1236T、 G2677T/A 和 C3435T 基因多态性具有群体代表性 （P > 0.05）。（2） 分子分型显示, 11例人类表皮生长因子受体2 （HER-2, 2+） 患者未行荧光原位杂交 （FISH） 检测予以剔除, 其中Luminal A型占41.90% （163/389）, Luminal B型占32.65% （127/389）, HER-2过表达型占13.62% （53/389）, 三阴型占11.83% （46/389）。（3） C3435T位点CT/TT基因型在Luminal A型患者中的频率高于其在HER-2过表达型和三阴型患者中的频率 （χ2 =12.011, P=0.001; χ2 =13.976, P < 0.001）, C1236T和G2677T/A基因多态性在不同分子分型中的分布差异无统计学意义 （P > 0.05）。结论 MDR1基因C3435T位点多态性可以为乳腺癌异质性提供更合理的补充, 不同乳腺癌分子分型患者中CT/TT基因表型可能对药物治疗更敏感。     

注射用丹参多酚酸对氧糖剥夺/复氧复糖小鼠脑微血管内皮细胞血管生成的影响及机制研究

目的 研究注射用丹参多酚酸（SAFI）对氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）损伤后小鼠脑微血管内皮细胞（BEND3）增殖、迁移、成管能力的影响及机制。方法 CCK-8法检测SAFI对正常BEND3细胞活力的影响，筛选出安全作用浓度。取正常生长的对数期BEND3细胞，分为对照组、模型组、SAFI（0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μg·mL^-1）组，模型组与SAFI组建立OGD/R模型，缺氧缺糖4 h、复氧复糖24 h；CCK-8法检测BEND3细胞活力；划痕实验检测BEND3细胞迁移能力；基质胶成管实验检测BEND3细胞成管能力；Western blotting法检测BEND3细胞血管内皮生长因子A（VEGFA）、血管生成素-1 （Ang-1）、Ang-2蛋白表达。结果 与对照组比较，模型组细胞活力、细胞迁移率及细胞成管血管网络的交叉点数、节点数、分支点数、血管总长度均显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，SAFI浓度为2.50、5.00、10.00 μg·mL^-1时细胞活力、细胞迁移率及细胞成管血管网络的交叉点数、节点数、分支点数、血管总长度、网眼总面积和VEGFA和Ang-1、Ang-2蛋白表达量均显著上升（P＜0.05、0.01），且作用呈浓度相关性。结论 SAFI可提高BEND3细胞OGD/R损伤后的增殖能力、迁移能力、成管能力，机制可能与上调VEGFA和Ang-1、Ang-2蛋白表达相关。     

UGT1A1*6 基因多态性与IP 方案治疗广泛期小细胞肺癌患者临床疗效和毒副反应的相关性分析

目的：探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1＊6（UGT1A1＊6）基因多态性与IP方案治疗的广泛期小细胞肺癌（ED-SCLC）患者临床疗效和毒副反应的相关性。方法选择2010年3月至2013年4月我院应用IP方案治疗的46例ED-SCLC患者,化疗前采全血提取基因组DNA,PCR法扩增目的基因片段,焦磷酸测序法测定UGT1A1＊6的基因多态性,化疗过程中观察并分析患者的临床疗效及不良反应的发生情况,探讨UGT1A1＊6基因多态性与不良反应和疗效之间的关系。结果46例患者中,UGT1A1＊6位点野生型G/G 34例（73％）,杂合突变型G/A 8例（17％）,纯合突变型A/A 4例（8％）。化疗期间,突变杂合型（G/A）及纯合突变型（A/A）患者3-4级腹泻和中性粒细胞减少的发生率明显高于UGT1A1野生型（G/G）（P〈0.05）,UGT1A1＊6各种基因型之间血小板减少的发生率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 UGT1A1＊6基因多态性与IP方案治疗ED-SCLC发生严重的腹泻和中性粒细胞减少有关,但与其临床疗效无关。     

抑制 BHK21细胞 STYK1/NOK基因的转录组分析 #br#

目的 转录组分析抑制丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸激酶 1（STYK1/NOK）后仓鼠肾正常细胞 BHK21的基因表 达,并分析其可能作用的信号通路。方法 BHK21细胞分为空载体组（转染 6 µg空载体 pBs/U6）、低转染浓度组（2 µg si-STYK1/NOK质粒+4 µg空载体 pBs/U6）和高转染浓度组（6 µg si-STYK1/NOK质粒）。转染 48 h后,Western blot 检测 STYK1/NOK蛋白表达,基于检测结果,选取空载体组和高转染浓度组提取总 RNA进行转录组测序。将测序所 得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,应用 R软件进行生物功能（GO）分析和 KEGG信号通路分析。应用 STRING蛋白质互作数据库中的互作关系进行差异基因蛋白互作网络的分析。采用 qRT-PCR验证关键差异表达基 因亚甲基四氢叶酸脱氢酶 2（Mthfd2）、转录激活因子 5（Atf5）,ⅡA分泌型磷脂酶 A2（Pla2g2a）、6-磷酸果糖-2-激酶/ 果糖-2,6-双磷酸酶 3（Pfkfb3）的表达。CCK-8法检测空载体组和高转染浓度组细胞增殖情况。结果 Western blot 结果表明高转染浓度组明显抑制 STYK1/NOK蛋白表达。高转染浓度组与空载体组相比,共发现差异表达基因 44 个,包括 19个上调基因和 25个下调基因。GO富集分析发现差异表达基因主要影响生物调控、细胞进程、代谢调控、 细胞生物过程、细胞、细胞部分、胞外区、配体和催化活性。KEGG通路分析发现差异表达基因主要集中作用于免疫 系统、癌症、细胞周期、信号转导和氨基酸代谢等方面。qRT-PCR结果表明,高转染浓度组Mthfd2、Atf5的相对表达量 显著上调（P＜0.05）,Pfkfb3、Pla2g2a的相对表达量显著下调（P＜0.05）,与测序结果相一致。细胞增殖实验表明高转 染浓度组细胞增殖明显高于空载体组（P＜0.01）。结论 抑制 BHK21细胞 STYK1/NOK表达后,致使 BHK21细胞原 癌基因表达增强,抑癌基因表达减少,促进细胞增殖。     

低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达

目的构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）真核表达载体的减毒沙门菌菌株（Ty21a-pIRES-HIF,IRES-KGF,TPHK）,观察其在防治肠黏膜损伤方面潜在的应用前景。方法采用RT-PCR法从低氧处理A549细胞扩增HIF-1αcDNA后连接到载体pIRES-SEQ的NheI和MluI酶切位点,构建单基因重组质粒pIRES-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板扩增KGF基因并克隆到重组质粒pIRES-HIF的XbaI和NotI酶切位点上,获得双基因重组质粒plRES-HIF-IRES-KGF。采用电穿孔法将pIRES-HIF-IRES-KGF质粒转人减毒沙门菌Ty21a中,通过筛选获得TPHK。该菌株转染肠上皮细胞IEC-6后48h,用ELISA法检测上清中HIFId和KGF的表达水平。并采用MTT方法分析不同剂量表达产物对IEC-6细胞的作用。结果通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实TPHK构建成功。TPHK转染正常肠上皮细胞IEC-6后,48h取上清用ELISA法检测HIF和KGF的表达,结果表明6×10^5个细胞可表达（16．03±1．47）ng的HIF蛋白和（17．77±1．83）ng的KGF蛋白。MTT结果表明表达上清有明显刺激正常肠上皮细胞IEC-6增殖的活性（P〈0．05）,加入20％表达上清时刺激活性达高峰。结论成功构建了TPHK,其可有效转染肠上皮细胞IEC-6,表达上清可显著促进IEC-6细胞增殖。提示TPHK具有潜在的在肠黏膜损伤局部应用的前景。     

佛山市汉族人群HIFIA基因1790（G→A）多态性研究

目的研究低氧诱导因子-1α基因（HIF1A）第12外显子1790（G→A）单核苷酸多态性在广东佛山市汉族人群中的分布特征。方法随机选取佛山市汉族健康个体90人的血样,提取白细胞基因组DNA,利用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应（restriction fragment length polymorphisrm-polymerase chain reaction, RFLP-PCR）技术检测HIF1A基因第12外显子1790（G＋A）的单核苷酸多态性基因型,并分析其基因多态性特征。结果HIF1A基因1790（G→A）单核苷酸多态性的GG、GA和AA基因型频率分别为75．56％、21．11％和3．33％,G、A等位基因频率分别为86．11％、13。89％。广东佛山汉族人群HIF1A基因1790（G→A）单核苷酸多态性等位基因分布频率与日本人群相比差异有显著意义（P〈0．05）。结论广东佛山汉族人群HIF1A基因1790（G→A）多态性以GG基因型分布频率高,具有一定的种族差异性。     

基于网络药理学和动物实验探讨柠檬苦素抗肝纤维化的作用机制

目的 通过网络药理学方法探讨柠檬苦素治疗肝纤维化的作用机制,并运用分子对接和动物实验进行验证。方法 首先,利用SwissTargetPrediction、GeneCards和DisGeNet等数据库筛选柠檬苦素和肝纤维化的靶点,并运用微生信网站获得柠檬苦素与肝纤维化的共同靶点。然后运用STRING数据库和Cytoscape软件构建共同靶点的蛋白质相互作用网络,并利用CytoNCA插件筛选核心靶点;使用Metascape数据库对共同靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,以预测其可能的作用机制。最后运用AutoDock Vina软件对柠檬苦素与核心靶蛋白进行分子对接验证,并将网络药理学预测结果进行动物实验验证。结果 预测结果表明柠檬苦素可能作用于AKT1、VEGFA、HIF1A等86个靶点,参与激素应答、蛋白磷酸化、血管生成等生物过程和PI3K/AKT通路、HIF-1通路、VEGF通路等与肝纤维化相关的信号通路。蛋白质相互作用分析结果显示核心靶点包括AKT1、VEGFA、HIF1A、PIK3CA等11个靶点。分子对接结果表明柠檬苦素与AKT1、VEGFA、HIF1A 3个核心靶蛋白具...     

丹参酮ⅡA抑制PI3K/AKT/NF-κB通路对炎性软骨细胞的保护作用

目的 研究丹参酮ⅡA对IL-1β诱导炎性软骨细胞的保护作用及PI3K/AKT/NF-κB通路的影响。方法 取SD大鼠10只,分离培养软骨细胞,分为正常组、丹参酮ⅡA（6.25,12.5,25,50 μmol·L^-1）剂量组,培养24 h后CCK8法检测软骨细胞增殖情况。另取软骨细胞分为正常组、IL-1β（10 ng·mL^-1）组和IL-1β+丹参酮ⅡA（6.25,12.5,25,50 μmol·L^-1）组共6组,IL-1β与丹参酮ⅡA共培养24 h。CCK8检测细胞增殖情况,ELISA法检测软骨细胞TNF-α、IL-6、PGE2、NO的含量水平。qRT-PCR和Western blotting检测软骨细胞iNOS、COX-2、collagen-Ⅱ、aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平及PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白表达水平。结果 对于正常软骨细胞,给予（12.5,25,50 μmol·L^-1）丹参酮ⅡA干预24 h可增加细胞增殖;对于IL-1β诱导的炎性软骨细胞,与IL-1β组相比,丹参酮ⅡA（25,50 μmol·L^-1）可增加细胞增殖（P<0.01）。IL-1β+丹参酮ⅡA（12.5 μmol·L^-1）组IL-6、PGE2、NO含量,COX-2、ADAMTS-5的mRNA表达及ADAMTS-5蛋白表达水平显著下降（P<0.05或P<0.01）,aggrecan蛋白表达水平上升（P<0.05）;IL-1β+丹参酮ⅡA（25,50 μmol·L^-1）组TNF-α、IL-6、PGE2、NO含量,iNOS、COX-2、MMP-13、ADAMTS-5的mRNA及蛋白表达,p-PI3K、p-AKT及p-P65蛋白表达水平显著下降（P<0.05或P<0.01）,collagen-II、aggrecan蛋白表达水平显著上升（P<0.05或P<0.01）。结论 丹参酮ⅡA可有效保护IL-1β诱导的炎性软骨细胞,可通过促进软骨细胞增殖,抑制炎症反应,抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,发挥保护作用。