卵巢癌紫杉醇耐药细胞耐药性和髓样分化因子88关系的研究

目的：研究卵巢癌亲本A2780细胞与卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol生物学特性及与髓样分化因子（Myeloid dif－ferentiation factor 88,MyD88）的关系。方法：应用CCK-8法检测A2780细胞和A2780/Taxol细胞的耐药性和耐药指数,采用流式细胞法检测A2780和A2780/Taxol细胞的细胞周期。应用罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）排出实验测定P-糖蛋白（P-gly－coprotein,P-gp）表达。应用Western blot检测A2780和A2780/Taxol细胞中P-gp的表达情况。应用细胞免疫化学检测A2780和A2780/Taxol细胞中MyD88、P-gp的表达情况。结果：A2780与A2780/Taxol相比,A2780/Taxol生长缓慢,呈G1期阻滞;CCK-8结果显示A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50为（36.81±2.05） μg/ml,A2780细胞对紫杉醇的IC50为（1.40±0.18） μg/ml;两者的耐药指数（Resistance index,RI）为26.35。Rh123排出实验显示A2780/Taxol平均荧光强度显著降低。Western blot检测发现A2780/Taxol的P-gp表达比A2780明显升高（P<0.05）。细胞免疫化学检测发现A2780/Taxol中的P-gp和MyD88表达明显高于A2780细胞。结论：A2780/Taxol细胞株具有明确的耐药性,紫杉醇耐药与MyD88的表达密切相关,该细胞株可用于卵巢癌紫杉醇耐药的基础研究。     

miR-141-3p表达与卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的相关性研究

［摘要］ 目的 探讨miR-141-3p在卵巢癌细胞对顺铂耐药中的表达和作用。 方法 采用实时荧光定量PCR法检测A2780/DDP细胞中miR-141-3p的表达水平;下调/过表达miR-141-3p后,采用CCK-8法检测卵巢癌细胞对顺铂的增殖率并计算药物IC50;采用Western blot法检测增殖相关蛋白（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达水平。 结果 miR-141-3p在顺铂耐药的卵巢癌细胞株A2780/DDP中的表达显著高于顺铂敏感的卵巢癌细胞株A2780（P＜0.05）。与对照组比较,A2780细胞中过表达miR-141-3p后可显著增加细胞对顺铂的IC50,增殖相关蛋白PCNA表达亦增加（P＜0.05）。与对照组比较,A2780/DDP细胞中下调miR-141-3p表达后,细胞对顺铂的IC50显著下降,增殖相关蛋白PCNA表达下降（P＜0.05）。 结论 miR-141-3p在顺铂耐药卵巢癌细胞的耐药机制中表达增加,下调miR-141-3p可增加顺铂耐药的卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。     

中药陵水暗罗提取物暗罗素逆转卵巢癌细胞顺铂耐药研究

目的:探讨陵水暗罗提取物暗罗素(ZPT)对耐药卵巢癌细胞株顺铂(DDP)敏感性的影响。方法:MTS法检测暗罗素和顺铂对卵巢癌细胞株A2780和耐药株A2780/DDP的增殖抑制效应。Western Blot法检测A2780和A2780/DDP细胞株p65蛋白表达水平,荧光素酶法检测A2780和A2780/DDP细胞株NF-κB活性。结果:暗罗素可以显著抑制人卵巢癌细胞株A2780和耐药株A2780/DDP的增殖活性[A2780和A2780/DDP的半数抑制浓度(IC50)值分别为1.498μmol/L和1.516μmol/L];联合组(0.5μmol/L暗罗素+5μmol/L顺铂)相对于顺铂单药组,显著下调A2780/DDP的增殖活性(80.80%vs 35.63%,P<0.01)。荧光素酶法检测A2780和A2780/DDP细胞株的NF-κB活性显示,A2780/DDP组NF-κB活性是A2780组的1.92倍(P<0.01);Western Blot法检测p65蛋白表达水平,提示A2780/DDP组p65蛋白表达显著高于A2780组。相对于对照组,0.5μmol/L暗罗素可以显著下调NF-κB活性(100%vs 39.69%,P<0.01)。Western Blot法检查0.5μmol/L暗罗素对A2780/DDP抗凋亡蛋白Bcl-2的影响,发现暗罗素可以显著抑制Bcl-2蛋白表达。结论:陵水暗罗提取物暗罗素可以增加顺铂耐药细胞株A2780/DDP对顺铂的敏感性,暗罗素下调NF-κB-Bcl-2途径活性可能是其逆转顺铂耐药机制。     

8-溴-7-甲氧基白杨素对顺铂耐药卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的影响

目的:研究8-溴-7-甲氧基白杨素(8-bromo-7-methoxychrysin,BrMC)诱导人顺铂耐药卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡作用及细胞凋亡过程中Akt蛋白磷酸化水平的变化。方法:用不同浓度的BrMC处理体外培养的A2780/DDP细胞,碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)和细胞凋亡ELISA检测试剂盒检测凋亡性细胞死亡,Western Blot分析Akt蛋白磷酸化水平。结果:BrMC具有诱导A2780/DDP细胞凋亡作用,并且随药物浓度的增加而增强;同时BrMC以浓度依赖的方式下降Akt蛋白磷酸化水平。结论:BrMC诱导A2780/DDP细胞凋亡与其抑制Akt活化相关。     

miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A和DNMT3B对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。方法以人卵巢癌细胞株(A2780)、人卵巢癌顺铂耐药细胞株(A2780/DDP)作为研究对象,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测A2780、A2780/DDP细胞株中miR-200b与miR-200c表达量。耐药细胞株A2780/DDP转染后分为si-miR-200b组、si-miR-200c组、si-NC组,MTT法检测转染后3组细胞IC50值;蛋白印迹免疫法(Western blotting)检测转染后3组细胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果qRT-PCR结果显示A2780细胞系中miR-200b与miR-200c表达高于A2780/DDP细胞系(P＜0.05)。 si-miR-200b组和si-miR-200c组IC50值、DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 蛋白表达水平低于si-NC组(P＜0.05)。结论miR-200b与miR-200c高表达能抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因表达,从而逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。     

顺铂作用下卵巢癌细胞株CP70中Eps8表达变化研究

目的:观察肿瘤相关抗原Eps8在卵巢癌细胞株A2780、CP70、SKOV3、SKOV3/DDP中的表达情况,筛查出Eps8高表达细胞株CP70。观察顺铂(DDP)作用下CP70细胞中Eps8在蛋白水平表达的变化,探讨Eps8在卵巢癌化疗耐药中的作用。方法:用实时荧光定量PCR法检测Eps8在卵巢癌细胞株中mRNA的表达水平,用Western blot法检测Eps8蛋白表达水平,筛选出高表达株CP70。用不同浓度DDP作用于CP70细胞24h、48h,用Western blot法检测Eps8在蛋白水平的变化。结果:随着药物浓度的增加及作用时间的延长,Eps8在蛋白水平的表达明显升高。结论:顺铂处理CP70细胞后,Eps8的蛋白表达量升高,且和DDP作用的时间及剂量有依赖性,即DDP可诱导CP70细胞中Eps8表达的上调。因此推测,Eps8在卵巢癌顺铂耐药形成机制中发挥重要作用。     

异丙酚对卵巢癌进展和顺铂敏感性的影响及机制

目的 探讨异丙酚对卵巢癌进展及顺铂(DDP)敏感性的影响及机制。方法 取对数生长期的卵巢癌细胞A2780和耐DDP卵巢癌细胞A2780/DDP,分别与异丙酚(0、1、5、10及20 mg/L)和DDP(0、5、10、20、40及80μmol/L)进行孵育,采用CCK-8法观察A2780和A2780/DDP细胞存活率;取对数生长期的A2780和A2780/DDP细胞分为Control组(等量培养基)、异丙酚组(10 mg/L异丙酚)、DDP组(10μmol/L DDP)、异丙酚+DDP组(10 mg/L异丙酚+10μmol/L DDP),克隆形成实验观察细胞克隆数,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-XL(Bcl-xl)单克隆抗体、细胞凋亡调节因子(Bim)及活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)表达,Transwell检测各组A2780和A2780/DDP细胞的侵袭;裸鼠移植瘤实验观察各组肿瘤生长情况。结果 A2780、A2780/DDP细胞活力随异丙酚和DDP浓度升高均下降,A2780/DDP细胞系半抑制浓度(IC_...     

IL-17A促进卵巢癌顺铂耐药的体外机制探讨

目的:探究IL-17A促进卵巢癌顺铂（DDP）耐药的体外机制。方法:应用流式细胞术分析外源性rhIL-17A对DDP诱导的A2780（顺铂敏感卵巢癌细胞株）和OVCAR3（顺铂耐药卵巢癌细胞株）细胞的凋亡和周期分布变化的影响,并以IL-17RAmAb进行相应的阻断实验。结果:rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞的凋亡无显著影响;但可显著降低DDP对A2780和OVCAR3细胞的毒性作用（P<0.05）,以IL-17RAmAb进行阻断实验可部分消除rhIL-17A对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡的阻滞作用（P<0.05）。rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞的周期分布无显著影响;但可显著抑制 DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞周期阻滞（P <0.05）,使A2780和OVCAR3细胞的G0/G1期比例增加,G2+S期比例减少。结论: IL-17A可通过IL-17RA抑制DDP诱导的卵巢癌细胞凋亡,同时可抑制DDP诱导的卵巢癌细胞周期阻滞,从而加剧以DDP为基础的卵巢癌化疗耐药性。     

肺耐药蛋白与卵巢癌顺铂耐药表型的相关性

目的探讨肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP）与人卵巢癌顺铂耐药细胞A2780／DDP顺铂耐药表型的关系及其分子机制。方法应用Lipofectamine^TM介导反义寡核苷酸（AsODN）体外转染人卵巢癌细胞；采用RT-PCR和Western blot法检测转染前后细胞中LRP基因的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测顺铂对转染前后细胞的杀伤效应；通过高效液相色谱仪（HPLC）检测经LRP AsODN或抗LRP单克隆抗体作用后，顺铂在A2780／DDP细胞质、核中的吸收和排泄情况。结果与非耐药亲本细胞A2780相比，A2780／DDP细胞内LRP表达明显增高。LRP AsODN能明显降低A2780／DDP细胞中LRP表达水平，逆转其顺铂耐药表型。经LRP AsODN或抗-LRP单克隆抗体作用后，A2780／DDP细胞中顺铂含量明显增高，尤以胞核中的含量上升为甚，而其从核中的排泄受到显著性抑制。结论LRP可能参与介导人卵巢癌细胞顺铂耐药表型的产生，并可能与顺铂在卵巢癌细胞胞质囊泡以及细胞核质交换中的代谢过程密切相关。     

拓扑替康对人卵巢癌顺铂耐药细胞株作用的研究

目的:探讨拓扑替康(TPT)在体外诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡的作用及其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法:应用TPT诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡,运用MTT法、透射电镜、DNA凝胶电泳检测和观察TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/杀伤效应、凋亡形态、生物特性。采用Westernblot印迹杂交法以检测TPT对凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响。结果:TPT可诱导细胞株A2780/DDP凋亡,经TPT作用后A2780/DDP细胞内bax蛋白增加,而bcl-2蛋白不表达,bax/bcl-2比值增加。结论:TPT可诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡,其机制可能与bax蛋白高表达及bax/bcl-2不表达有关。     

乳源免疫调节肽通过泛素-蛋白酶体途径抑制卵巢癌耐药性及其机制研究

目的 研究乳源免疫调节肽(PGPIPN)抑制卵巢癌耐药性及其机制.方法 MTT法检测PGPIPN与抗癌药顺铂(DDP)联合用药抑制人卵巢癌敏感细胞株(SKOV3)、耐药细胞株(SKOV3-DDP)和原代卵巢癌细胞的半数抑制浓度(IC50)和细胞增殖抑制率,PCR法和Western blot法检测人卵巢癌细胞株和原代卵巢癌细胞用药情况下泛素-蛋白酶体途径相关基因的表达.结果 PGPIPN和DDP联合用药细胞增殖抑制率显著高于单独DDP组或PGPIPN组,差异有统计学意义( P＜0. 05),PCR和Western blot结果表明 PG-PIPN通过调节泛素-蛋白酶体途径相关基因表达降低卵巢癌细胞的耐药性. PGPIPN促进SIAH和PSMA1 表达,降低β-catenin基因的表达(P ＜0. 05,P ＜0. 01),且有剂量依赖性.结论 PGPIPN通过泛素-蛋白酶体途径降低卵巢癌细胞对DDP的耐药性.     

miR-130a对卵巢癌A2780细胞顺铂耐药性的影响及其机制的研究

目的 探讨miR-130a表达的改变对卵巢癌A2780细胞（包括顺铂敏感细胞株A2780s和耐药株A2780/DDP）顺铂耐药性的影响及其机制。方法 将A2780s、A2780/DDP细胞各分为4组,分别予以单纯脂质体处理、转染阴性对照小RNA、miR-130a模拟物(可使miR-130a表达增加)、miR-130a抑制物(降低miR-130a表达)处理,MTS法检测各组细胞增殖情况和对顺铂的耐药性,RT-PCR、Western blot 法检测未处理和处理后细胞多耐药基因1（MDR1）、抑癌基因（PTEN） mRNA和蛋白的表达。结果 A2780/DDP细胞MDR1 mRNA和MDR1的表达产物P-糖蛋白(P-gp）的表达高于A2780s细胞（PMDR1 mRNA和P-gp表达水平;下调miR-130a的表达,同样不影响细胞的增殖, 但增强其对顺铂的敏感性, 并可降低MDR1 mRNA和P-gp的表达,提高PTEN蛋白的表达。结论 miR-130a抑制物通过上调PTEN蛋白和下调P-gp的表达来逆转卵巢癌A2780细胞系对顺铂的耐药性。miR-130a有望成为耐药性卵巢癌基因治疗的新靶点。     

卵巢癌细胞系Smac基因的表达及意义

目的 探讨Smac基因在卵巢癌细胞系A2780、COC1及其顺铂(DDP)耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中的表达及其意义.方法 半定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法检测卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中Smac mRNA和蛋白的表达.结果 卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP四种细胞系中均有Smac mRNA和蛋白的表达;Smac在A2780、COC1中的表达高于其顺铂耐药株.结论 低表达Smac抑制凋亡,低表达Smac可能与耐药有关.     

IL-17A对卵巢癌顺铂耐药的影响及其影响机制的研究

?目的: 探究IL-17A 对卵巢癌（OVCA）顺铂(DDP)耐药的影响及其可能的作用机制。方法:应用MTT 法检测IL-17A（0.1、1、10、100 ng/mL,处理12、24、48、72 h）对A2780（顺铂敏感卵巢癌细胞株）和OVCAR3（顺铂耐药卵巢癌细胞株）增殖的影响;应用MTT 法检测IL-17A（1 ng/mL,处理 24 h）对A2780 和OVCAR3 细胞DDP 耐药的影响,并以rhIL-17RA 中和抗体（IL-17RAmAb）和Gli1 抑制剂Gant61 进行相应的阻断实验;应用Western blotting 法检测IL-17A 处理A2780 和OVCAR3细胞后,细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1 和Hedgehog（Hh）信号通路核转录因子Gli1 的蛋白表达,并分别以IL-17RAmAb 和Gant61 进行相应的阻断实验。结果: IL-17A 对A2780 和OVCAR3 的细胞增殖无显著性影响,但可显著增加DDP 降低的A2780 和OVCAR3 细胞活性（P<0.05）,分别以IL-17RA mAb 和Gant61 进行阻断实验均可消除由IL-17A 加剧的A2780 和OVCAR3 细胞DDP 的耐药性;IL-17A 可上调A2780

和OVCAR3 细胞耐药相关分子ABCG2,MDR1 和Gli1 的蛋白表达并且分别以IL-17RAmAb 和Gant61 进行阻断实验均可抑制IL-17A 引起的A2780 和OVCAR3 细胞中ABCG2,MDR1 和Gli1 蛋白表达。结论: IL-17A可作用于IL-17RA并激活Gli1介导的Hh信号通路,进而促进耐药相关分子ABCG2和MDR1表达,从而加剧以DDP为基础的OVCA化疗耐药性。     

KLK11对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探究激肽释放酶相关肽11(KLK11)对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:qRT-PCR及Western blot技术检测卵巢癌细胞中KLK11基因的表达水平。Western blot评估siRNA特异性抑制KLK11在A2780和HO8910细胞株中表达的抑制效率。CCK-8、划痕实验及Transwell实验检测KLK11对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测卵巢癌细胞中上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指转录因子(Snail)的表达水平。结果:与人正常卵巢上皮细胞相比,KLK11在卵巢癌细胞株中表达上调(P<0.01);与Control组相比,si-KLK11组卵巢癌细胞中KLK11蛋白表达降低(P<0.01),卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力被抑制(P<0.01);同时,si-KLK11组A2780和HO8910细胞中Vimentin、Snail蛋白表达水平均下调(P<0.01),而E-cadherin蛋白表达水平上调(P<0.01)。结...     

Effect of Silencing EZH2 on Drosha Gene Expression in Cisplatin-resistant Ovarian Cancer Cell Line A2780/DDP

目的 探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响.方法 获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达.结果 以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%.结论 沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达.     

过氧化氢联合低频超声波诱导卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的研究

目的探讨过氧化氢联合超声波诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的效果。方法体外培养人卵巢癌A2780/DDP细胞,MTT法研究过氧化氢对卵巢癌A2780/DDP细胞生长抑制情况,选择过氧化氢对A2780/DDP细胞作用的合适作用参数;实验分为对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组,10μmol/L过氧化氢组,10μmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组;不同因素作用A2780/DDP细胞24 h后,Hoechst33258染色观察细胞形态变化;流式细胞仪检测各处理因素作用A2780/DDP细胞的凋亡率;Western blot检测各组细胞caspases-9蛋白表达量的改变。结果对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组和10μmol/L过氧化氢组无明显凋亡改变,而10μmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组与对照组之间比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论过氧化氢联合超声波能增强诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的作用。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞EZH2基因沉默对Drosha基因表达的影响

目的探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响。方法获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达。结果以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%。结论沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

Drosha基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达研究

目的 探讨Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药的关系.方法 分别采用实时定量PCR和免疫印迹法检测Drosha基因mRNA及其蛋白在A2780/DDP及A2780细胞中表达的差异.结果 A2780/DDP细胞中Drosha基因mRNA及其蛋白的表达量分别是A2780细胞表达量的(56.79±1.65)%和(50.16±1.34)%,两者比较差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 Drosha基因在A2780/DDP细胞中明显下调,提示Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药相关.     

RNA干扰靶向沉默FLIP基因对卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用

目的探讨靶向FLIP基因的小干扰RNA（siRNA）对人卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用。方法设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA，在脂质体（LipofectamineTM2000）介导下转染人卵巢癌细胞株A2780。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测FLIP siRNAs转染前后A2780细胞FLIP基因mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用最强的FLIP-siRNA。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）分别检测FLIP-siRNA转染对A2780细胞的生长抑制作用和对凋亡的影响。结果特异性FLIP-siRNAs片段能有效降低A2780细胞中FLIP的 mRNA和蛋白水平（P＜0.01）,最大抑制率分别为77.4％和66.1％；转染FLIP-siRNA后，A2780细胞的生长活力明显下降（P＜0.05），RNA干扰组的细胞凋亡也显著增加（P＜0.05）。结论靶向FLIP基因的siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP基因表达；并可抑制卵巢癌A2780细胞生长，促进其凋亡。