TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

重组白细胞介素10-pEGFP-N2质粒构建及表达

目的 将IL-10基因定向克隆入pEGFP-N2质粒，探讨采用构建的质粒转染支气管上皮细胞H292朱，稳定表达IL-10和荧光蛋白可行性。方法 采用定向克隆技术，将IL-10基因克隆入pEGFP-N2质粒，用构建成功的IL-10--pEGFP-N2质粒在Fuge-6介导下转染培养的支气管上皮细胞株（H292)，利用免疫组化、RT-PCR检测细胞中IL-10蛋白白和mRNA的表达，并在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达，结果 （1）重组后的pEGFP-N2质粒已成功载入IL-10基因。（2）IL-10--pEGFP-N2质粒转染支气管上皮细胞H292株后，可在H292株内表达IL-10mRNA,IL-10蛋白和荧光蛋白。结论 重组的IL-10--pEGFP-N2质粒可在上皮细胞内表达IL-10和荧光蛋白。由于两者共用一个启动子，荧光蛋白表达可报告IL-10表达，适用于动物实验气道内的IL-10转基因研究。     

pcDNA3.1-HMOX1重组质粒载体的构建与鉴定

目的：构建pcDNA3．1－HMOX1重组质粒载体。方法使用基因合成法合成HMOX1基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3．1载体的BamHⅠ和 NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。结果 pCDNA3．1－HMOX1重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因HMOX1的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。结论成功构建pCDNA3．1－HMOX1融合基因并在DH5α大肠杆菌内表达,为进一步探讨HMOX1的生物学功能奠定了基础。     

变形链球菌表面蛋白PAc功能区基因重组质粒的亚克隆构建

将变形链球菌pac基因待表达部分克隆人哺乳动物表达质粒中构建成将用作DNA免疫防龋研究的重组质粒.用PCR扩增出pac基因的2个高度保守区域,扩增产物以pGEM-T为载体进行亚克隆后,再克隆至高效哺乳动物表达质粒pCI构建成重组体,重组质粒pCIA-P经限制性酶切分析及DNA测序分析证实克隆构建正确.对含pac基因重要抗原决定簇区域的成功克隆为DNA免疫防龋研究完成了重要准备.     

重组质粒pcDNA3.1/C-sis对大鼠FHF的影响

目的 探讨重组质粒peDNA3.1/C-sis导入大鼠对暴发性肝功能衰竭(FHF)的影响.方法 利用流体力学的方法将重组质粒pcDNA3.1/C-sis导入大鼠肝脏,48 h后用内毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)诱导大鼠FHF;利用荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blotting)检测C-sis表达;利用苏木精-伊红(HE)染色及测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性检测凋亡;利用Western Blotting检测Bcl-2和Bax的表达变化;计算大鼠24 h观察期内的死亡率.结果 FHF+C-sis质粒组的C-sis mRNA和蛋白表达水平较正常对照组和FHF+空载质粒组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).与正常对照组相比,FHF+林格液注射组和FHF+空载质粒组肝脏细胞凋亡增多;与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组肝脏细胞凋亡减少.与正常对照组相比,FHF+林格液注射组大鼠肝脏组织中Caspase-3的表达增多(P＜0.01);与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组大鼠肝脏组织中Caspase-3的表达减少(P＜0.05).与正常对照组相比,FHF+林格液注射组大鼠肝脏组织中Bcl-2表达明显减少(P＜0.01),Bax表达明显增多(P＜0.01);而与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组大鼠肝脏组织中Bcl-2表达增多(P＜0.05),Bax表达减少(P＜0.05).在24 h观察期内,正常对照组大鼠均存活,FHF+林格液注射组及FHF+空载质粒组大鼠死亡率分别为70.0％和80.0％;而FHF+C-sis质粒组大鼠仅2o.0％死亡.结论 C-sis基因可减弱LPS+ D-GalN诱导的大鼠FHF.     

人白介素—1β转换酶的克隆及重组质粒构建

白介素－1β转换酶（nitereukin－1β－conver－tingenzyme，ICE）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一员。研究提示，ICE可能在哺乳类细胞凋亡过程中起重要作用。为进一步了解该基因在凋亡诱导中的作用，以及潜在的临床应用价值，我们克隆了人ICE的CDNA序列，并构建了相应的真核?..     

赖型钩体重组质粒pDJH2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为本重疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别一ＰＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化为大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达，结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ，ｐＤＪｒＢ能在大肠杆菌中一致，免疫印迹在６８ｋｄ处分别有印迹，用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强和株攻击，表现出免疫保护作用本实验结     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

变形链球菌表面蛋白PAc功能区基因重组质粒的亚克隆构建

将变形链球菌pac基因待表达部分克隆人哺乳动物表达质粒中构建成将用作DNA免疫防龋研究的重组质粒。用PCR扩增出pac基因的2个高度保守区域,扩增产物以pGEM-T为载体进行亚克隆后,再克隆至高效哺乳动物表达质粒pCI构建成重组体,重组质粒pCIA-P经限制性酶切分析及DNA测序分析证实克隆构建正确。对含pac基因重要抗原决定簇区域的成功克隆为DNA免疫防龋研究完成了重要准备。     

慢性肝炎患者IL-2及其受体与IL-6、T细胞亚群的关系

目的 研究慢性肝炎与肝硬化患者ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－６、Ｔ细胞亚群的变化和意义。方法 分别采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法、ＡＢＳ－ＥＬＩＳＡ法和红细胞花环实验对７４例慢性病毒性肝炎与肝炎肝硬化进行ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－６和Ｔ细胞亚群群的测定,并与６６例健康献血员进行对照。结果 慢性肝炎轻度（ＣＨ－Ｉ）ＩＬ－２水平高于正常对照（ＮＣ）组,慢性肝炎中度（ＣＨ－Ⅱ）、慢性肝炎重度（ＣＨ－Ⅲ）     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

PET32a-CDK2重组质粒的构建与表达

目的 构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的PET32a-CDK2重组质粒,利用原核表达体系表达CDK2蛋白.方法 从人白细胞中提取总RNA, 采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆.将克隆得到的PET32a-CDK2重组质粒转化...     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

pGEX-4T-1/HSV2-gG重组质粒的构建及表达

目的 通过基因工程技术,构建含有目的 基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-gG).方法 用PCR技术扩增HSV2-gG基因的免疫优势表位片断;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的 基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的 蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的 蛋白.结果 PCR法扩增出1 242 bp的DNA片断;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片断.SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达.结论 重组质粒HSV2-gG-pGEX-4T-1的成功构建及表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础.     

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

基因变构IL-2重组克隆的构建

①目的 构建基因变构IL-2（88ArgIL-2)的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后，获得cDNA文库，并以此为模板，经套式PCR扩增得IL-2的基因编码序列。测序确认正确后，设计含有突变位点的引物，经pCR定点诱变技术获得变构IL-2克隆并进行序列确定。③结果 IL-2基因定点诱变成功，并获得了基因变构IL-2重组克隆。④结论 IL-2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2奠定了基础。