负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。     

外源性Wnt-3a促进急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与细胞周期进展

目的 应用重组腺病毒介导的Wnt-3a激活急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中的经典Wnt/β-catenin信号途径,观察该途径激活后对Jurkat细胞增殖及细胞周期的影响,初步探讨其在急性T淋巴细胞白血病分子发病机制中的作用.方法 将携带Wnt-3a基因的重组腺病毒(Ad5-Wnt-3a)感染Jurkat细胞,实验分为3组:实验组(Jurkat/Ad5-Wnt-3a)、空载体组(Jurkat/Ad5-GFP)和空白对照组(Jurkat).转染后,采用RT-PCR方法检测Jurkat细胞内Wnt-3a mRNA的表达;Western blot检测细胞内β-catenin蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞周期,RT-PCR检测Wnt信号通路下游靶基因c-myc和cyclin D1 mRNA表达.结果 重组腺病毒Ad5-Wnt-3a转染Jurkat细胞后48 h,实验组有效表达Wnt-3a的基因.Western blot结果显示,与对照组比较,实验组细胞内β-catenin蛋白表达明显增加(P<0.05).MTT结果显示,Wnt-3a转染后48 h和72 h可明显促进Jurkat细胞的增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).FCM检测发现,Wnt-3a转染后可引起细胞G0/G1期下降,S期升高(P<0.05).RT-PCR检测结果显示细胞内c-myc和cyclin D1 mRNA表达升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 腺病毒介导的Wnt-3a可以激活Jurkat细胞中的经典Wnt/β-catenin信号途径,使Jurkat细胞增殖,促进细胞周期进展,其可能的机制是通过调控其下游靶基因c-myc和cyclin D1的表达实现.     

双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

目的：构建由人端粒酶启动子（hTERT）和缺氧诱导因子启动子（HIF）双向调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒,体外试验其对肿瘤的杀伤功能。方法：将hTERT和HIF分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的E1A和E1B序列前,调控E1A和E1B蛋白的表达,共同转染人胚肾293细胞进行同源重组,获得双调控选择性复制性腺病毒,进行PCR鉴定。获取病毒转染膀胱肿瘤细胞EJ,MTT检测细胞存活和生长情况。结果：淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h,实验组肿瘤细胞明显少于对照组;MTT检测实验组在12、24、48h活细胞数低于对照组。结论：成功构建了携带SEA基因的选择性腺病毒,且其可表达目的基因,对膀胱肿瘤细胞有一定的杀伤作用。     

HepaCAM基因对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用研究

目的:研究hepaCAM基因对人膀胱癌T24细胞增殖的影响.方法:运用脂质体转染方法,将pEGFP-N2-hepaCAM质粒转入T24细胞株,经G418筛选获得稳定表达的细胞株;RT-PCR及Western blot方法检测目的基因和蛋白表达;MTT法及克隆形成实验研究hepaCAM基因对T24细胞体外生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR技术测定周期调控蛋白CyclinD1的mRNA表达变化.结果:RT-PCR和Western blot方法分别检测到hepaCAM的基因表达和蛋白表达,MTT检测转染hepaCAM基因的细胞生长速度较对照组和空载体组明显减慢(P<0.01),克隆形成率明显小于对照组和空载体组(P<0.01).细胞周期中G0/G1期比例明显增高(P<0.05),而S期比例减少;CyclinD1 mRNA表达明显下调(P<0.05).结论:HepaCAM基因通过阻滞细胞于G0/G1期,减少CyclinD1 mRNA表达,抑制T24细胞的增殖.     

hTERT上调FOXM1乙酰化影响胃癌细胞侵袭能力

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)促进胃癌细胞侵袭的分子机制.方法 构建稳定过表达hTERT的细胞株SGC-7901-hTERT,采用Western blot检测叉头盒蛋白(forkhead box M1,FOXM1)的表达,qRT-PCR和Western blot检测FOXM1下游侵袭相关基因基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1的shRNA干扰质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中转染该质粒,Transwell法检测细胞侵袭能力,qRT-PCR和Western blot检测MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1启动子活性报告质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中用双荧光素酶报告实验检测FOXM1启动子活性,qRT-PCR检测FOXM1 mRNA表达;构建稳定过表达FOXM1的细胞株SGC-7901-HA-FOXM1,并在此细胞中转染hTERT过表达质粒,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测FOXM1乙酰化水平变化,免疫荧光实验检测hTERT与FOXM1的细胞定位.结果 与对照组比较,过表达hTERT促进FOXM1及其下游分子MMP-2、MMP-9的蛋白表达,同时也促进肿瘤细胞侵袭(P＜0.01),但不影响FOXM1的启动子活性及mRNA表达;与过表达hTERT组比较,干扰FOXM1可抑制MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达,同时也抑制肿瘤细胞侵袭(P＜0.01);hTERT与FOXM1存在细胞共定位,且过表达hTERT可上调FOXM1乙酰化水平.结论 hTERT通过上调FOXM1乙酰化促进胃癌细胞侵袭.     

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

利用体外合成mRNA方法研究Betatrophin对糖代谢关键基因表达的影响

目的:利用体外合成mRNA的方法研究新基因Betatrophin在HepG2细胞中对糖代谢关键基因表达的影响。方法:以合成Betatrophin mRNA的质粒为模板,体外合成Betatrophin mRNA转染入HepG2细胞,利用免疫荧光和Western blot检测Betatrophin mRNA在细胞内Betatrophin蛋白过表达情况,再利用qPCR和Western blot检测Betatrophin过表达对糖代谢关键基因表达影响。结果:成功构建Betatrophin mRNA合成载体,体外合成的Betatrophin mRNA可高效转染到HepG2细胞株中并正确表达Betatrophin蛋白,高表达的Betatrophin可上调糖代谢关键基因Glut2表达。结论:本实验初步证实Betatrophin可能是通过调控Glut2表达来影响糖代谢,为进一步研究Betatrophin对调控糖代谢的分子作用机制打下基础。     

Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制

目的 将已构建验证成功的重组腺病毒Ad-NLS-RARα感染至HL-60细胞中,探讨其对HL-60细胞增殖及全反式维甲酸（ATRA）诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。方法 将验证正确的腺病毒经Protamine sulfate辅助感染HL-60细胞,检测感染效率,用RT-PCR和Western blot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24 h后,用2.5 μmol/L ATRA处理,流式细胞术（FCM）检测细胞表面分化抗原CD11b的表达。RT-PCR和Western blot检测C-MYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果 在Protamine sulfate辅助感染作用下,重组腺病毒Ad-NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad-KZ对HL-60细胞的感染效率可达70%～80%。NLS-RARα基因的RT-PCR和Western blot结果显示,感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的HL-60细胞的NLS-RARα基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P<0.05）。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高 (P<0.05)。FCM检测结果显示,经ATRA处理后,感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的HL-60细胞,CD11b表达较阴性对照组和未感染组下调（P<0.05）。C-MYC基因的RT-PCR和Western blot检测结果表明,经ATRA 处理后,感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的细胞C-MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组(P<0.05)。结论 重组腺病毒Ad-NLS-RARα可以促进HL-60细胞的增殖,并通过上调C-MYC基因的表达,抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。     

前列腺非雄激素依赖启动子介导的双反义腺病毒的制备及组织特异性检测

目的  制备前列腺非雄激素依赖启动子（PSES）介导的鸟氨酸脱羧酶(ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)双反义腺病毒。方法  构建pShuttle-Basic-PSES AdoMetDC-ODC-PolyA穿梭载体,并与载体pAdPL进行体外重组,包装成重组腺病毒。将重组腺病毒转染至前列腺癌、直肠癌等癌细胞中,噻唑兰比色（MTT）法观察其对细胞增殖的影响,Western Blot检测重组腺病毒对细胞中ODC和AdoMetDC表达的抑制作用。结果  成功构建了前列腺特异的ODC和AdoMetDC双反义RNA表达载体,并包装制备出能特异的在前列腺细胞中表达产生ODC和AdoMetDC反义RNA的重组腺病毒。该重组腺病毒具有前列腺组织特异性。结论  构建的前列腺非雄激素依赖启动子介导的ODC、AdoMetDC双反义腺病毒具有组织特异性。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

腹腔注射内皮抑素腺病毒治疗原位胰腺癌的实验研究

目的探讨腹腔注射内皮抑素腺病毒治疗裸鼠原位胰腺癌的机制,观测其疗效。方法通过细胞内同源重组方法构建携带内皮抑素重组腺病毒Ad-mEndo,体外转染胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3,并测定感染的胰腺癌细胞上清液（鼠源性内皮抑素）mEndostatin蛋白的表达。荷瘤裸鼠腹腔注射腺病毒液Ad-mEndo,观察原位胰腺癌肿瘤的大小及测定肿瘤微血管密度。结果重组腺病毒Ad-mEndo体外能转染胰腺癌细胞株,并表达mEndostatin mRNA及蛋白。重组腺病毒Ad-mEndo治疗组肿瘤体积和微血管密度均显著小于生理盐水组,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论重组腺病毒Ad-mEndo腹腔注射能有效抑制裸鼠原位胰腺癌的生长,为胰腺癌的治疗探索了一种新的治疗途径。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

鼠IFN-λ2腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体。方法:用人水疱口炎病毒诱导小鼠原代脾细胞表达IFN-λ2,通过RT-PCR获取IFN-λ2 cDNA,将其亚克隆至pShuttle-CMV载体,经PmeⅠ线性化后,与腺病毒的骨架载体pAdEasy在BJ5183菌中同源重组,转染293A细胞包装扩增,RT-PCR检测重组腺病毒的目的基因,TCID50法对构建的腺病毒进行滴度测定。用鼠IFN-λ2重组腺病毒感染小鼠肺腺癌细胞,蛋白质印迹法检测细胞中IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜观察鼠IFN-λ2重组腺病毒对鼠肺腺癌细胞生长的抑制作用。结果:成功克隆鼠IFN-λ2的cDNA,序列与基因库公布序列完全一致;经酶切鉴定表明成功构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体;重组腺病毒载体在293A细胞中成功包装及扩增;包装成功的重组腺病毒中含有目的基因,病毒滴度为2×1010pfu/ml;蛋白质印迹显示感染细胞的上清中有鼠IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜显示感染的鼠肺腺癌细胞生长受到抑制。结论:成功构建了鼠IFN-λ2重组腺病毒载体,并能介导鼠IFN-λ2蛋白的表达进而抑制鼠肺腺癌细胞的生长,为进一步开展抗肿瘤研究及基因治疗奠定基础。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体,检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,构建分别携带Survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pSurp-EGFP和pCMV-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Adeno-SP-EGFP和Adeno-CMV-EGFP,分别转染BIU87及SV-HUC-1,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP,其转染BIU87及SV-HUC-1后,在荧光显微镜下可以观察到BIU87细胞呈现出较强绿色荧光,而SV-HUC-1细胞中仅有散在少量绿色荧光。结论成功制备的携带有Survivin启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,为下一步进行肿瘤特异性的基因治疗研究奠定了基础。     

重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外活性作用的研究

目的:研究表达人内皮细胞抑制素(endostatin)的腺病毒载体的体外活性作用.方法:用重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外转染人结肠癌SW620细胞,观察肿瘤细胞生长情况,并观察其上清对大鼠肺毛细血管内皮细胞、新生牛主动脉内皮细胞及人脐静脉内皮细胞生长的影响.结果:MTT法检查证实重组腺病毒对结肠癌细胞生长无抑制,锥虫蓝染色证实转染的人结肠癌SW620细胞上清对各种血管内皮细胞的生长均有较强的抑制作用.结论:重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外对各种血管内皮细胞生长均有较强的抑制作用,为进一步的动物实验奠定了基础.