大鼠海马神经元癫(癎)模型中神经元凋亡及caspase 3基因的表达

目的:探讨体外培养大鼠海马神经元癫(癎)模型中神经元丢失的分子机制.方法:制备大鼠海马神经元癫(癎)样放电细胞模型,以膜片钳全细胞记录对模型放电进行检测,采用RT-PCR法克隆大鼠全长caspase 3 cDNA,采用原位杂交和流式细胞术检测模型中caspase 3基因表达和神经元凋亡情况.结果:成功克隆获得大鼠全长caspase 3 cDNA,其序列与文献报道一致.模型组海马神经元癫(癎)样放电3 h后caspase 3基因表达开始增多,6 h后凋亡细胞开始明显增加,两者均较对照组明显增加.结论:癫(癎)样放电可能启动神经元caspase 3表达,继而介导神经元凋亡.     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

利用SMART技术构建中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库

目的: 针对人类肝脏蛋白质组计划中大规模基因克隆及构建肝脏蛋白相互作用图谱的研究需要,改造酵母双杂交载体pPC86和pDBleu,并构建中国人肝组织cDNA文库,为肝脏蛋白质组计划的研究奠定基础。 方法: 设计并合成特定寡核苷酸序列,经过处理形成具有黏性末端的双链DNA片段,插入到pPC86、pDBLeu载体相应的酶切位点处,从而获得改造的新载体。利用改造后的载体、中国人正常肝组织mRNA和Clontech公司SMART文库构建试剂盒构建NpDBLeu-cDNA文库。 结果: 酶切鉴定和DNA测序证实改造后载体插入位点和序列正确,成功获得新载体NpPC86和NpDBLeu。滴度测试表明,所构建NpDBLeu肝组织cDNA文库容量为1.93×10⁶ cfu,转化子重组效率为95.2%,扩增文库达到109cfu·mL^-1。 结论: 利用SMART技术成功构建了中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库。     

ompL17基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定

目的寻找钩体致病的信号传导通路，分析ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白。方法分别构建诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库，通过顺序性转染转入酵母细胞中，然后进行初步的鉴定。结果PCR和酶切分析证实构建成功了诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库。结论成功构建酵母双杂交系统为发现ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础。     

HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。     

杏仁核点燃癫(癎)大鼠脑内P-糖蛋白的表达

目的研究杏仁核电刺激点燃的难治性癫癎大鼠脑内P-糖蛋白（P-glycoprotein,PGP）表达的情况。方法建立杏仁核电刺激点燃的难治性癫癎大鼠模型,用RT-PCR、免疫组织化学及免疫蛋白印记（Western blot）的方法,分析比较PGP蛋白在癫癎模型组与正常对照组的表达。结果在基因和蛋白水平药物难治性癫癎大鼠组皮层和海马PGP的表达都显著高于正常对照组（P〈0.05）,癫癎模型组内皮层和海马间的多药耐基因1（multidrug resistance gene1,MDR1）的表达无明显统计学差异（P〉0.05）;癫癎组大鼠脑内皮层和海马的PGP免疫阳性细胞数较对照组明显增多,统计学比较有差异（P〈0.05）。结论癫癎大鼠脑内高表达的PGP参与了难治性癫癎的耐药机制。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

丙戊酸在自由活动癫癎大鼠海马的神经药物动力学过程

目的探讨丙戊酸在正常及癫癎大鼠海马神经元间隙液中的神经药物动力学过程.方法建立大鼠慢性癫癎模型及自由活动的清醒动物脑内在体微透析模型,结合荧光偏正免疫分析法测定急性腹腔注射丙戊酸(200mg/kg)后该药在大鼠海马胞外的动力学过程.用3P87药物动力学程序对药浓-时间数据进行拟合.结果丙戊酸在正常及癫癎大鼠海马胞外的峰浓度(Cmax)与药时曲线下面积(AUC0→∞)分别为(93.09±54.82)、(235.3±93.2)μg/mL及(6 252±3 607)、(19 286±5 219)μg·min·mL-1(n=5).结论推测由戊四氮诱发的大鼠脑病理性改变可能导致了丙戊酸在癫癎大鼠海马的蓄积,该研究为丙戊酸的临床抗癫癎治疗提供了新的实验资料.     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

CYP1A1、GSTM1和GSTT1基因多态性与甘肃省武威市食管癌易感性的关系

目的探讨甘肃省武威市食管癌组织中生物代谢酶Ⅰ相酶细胞色素（CYPIA1）和Ⅱ相酶谷胱甘肽转硫酶MI（GSTM1）、谷胱甘肽硫转移酶TI（GSTT1）基因多态性与食管癌的关系。方法采用PCR-RFLP、multiplex—PCR方法检测216例正常对照f血液）和189例食管癌组织中代谢酶基因CYPIA1和GSTM1、GSTT1的多态性。结果食管癌病例组与正常对照组中：CYP1A1基因MspⅠ酶切位点多态性的频率分别为74．1％和67．6％,差异无统计学意义;GSTM1纯合缺失基因型分别占58．7％和41．2％,差异有统计学意义（P〈0．05）,该基因型可能与食管癌易感性的增高有关（OR1．956）;GSTT1纯合缺失基因型分别占51．9％和43．5％,差异无统计学意义,该基因未明显增加对食管癌的易感性（OR1．169）;GSTM1、GSTT1联合缺失基因型在病例组和对照组中的频率分别为38．6％和19．6％,差异有统计学意义（P〈0．05）;同时携带CYPIA1MspⅠ多态突变基因型与GSTM1、GSTT1缺失基因型的个体患食管癌的风险增加（OR2．385,95％CI1．094-3．495）。结论单独的CYP1A1MspI多态突变基因型或者GSTT1缺失基因型与食管癌的易感性不相关;GSTM1纯合缺失基因型及其与GSTT1缺失基因型、CYP1A1MspⅠ多态突变基因型同时存在可增加个体患食管癌的风险,提示GSTM1纯合缺失基因型可能为食管癌发病的易感因素之一,且与其他缺陷基因型存在协同作用。     

代谢酶基因多态性与胃癌遗传易感性的研究进展

胃癌的发生是一个遗传和环境等多因素共同作用的过程,人体对内外源性致癌物的代谢能力影响个体对胃癌的易感性。影响胃癌遗传易感性的代谢酶基因主要有:与Ⅰ相代谢有关的CYP1A1、CYP2E1基因和与Ⅱ相代谢有关的GSTM1、GSTT1基因等。代谢酶基因多态性在胃癌发病中的重要作用已被越来越多的研究所证实。     

抗流1号对发热患者预防甲型H1N1流感的临床分析

目的：研究抗流1号对197例发热患者甲型H1N1流感的预防。方法：体温T≥37.5℃的患者197例,根据患者有无接触甲型H1N1病例,分为密切接触组25例,一般接触组48例,非接触组124例。进行体格检查、查血常规和胸片,服用抗流1号中药制剂（红景天、大青叶、虎仗和贯众）,根据症状和病情给予中医辨证治疗或抗生素及抗病毒治疗,观察患者一般情况,比较治疗情况。结果：密切接触组中性粒细胞和淋巴细胞降低的患者明显多于非接触组（P〈0.01）;用抗病毒治疗的患者密切接触组与非接触组比较有显著差异（P〈0.01）,中医辨证治疗的患者密切接触组与非接触组比较有差异（P〈0.05）。结论：以扶正和清热解毒为主的抗流1号能有效的预防甲型H1N1的传播可以起到降低发病率、减轻病情,值得推广应用。     

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平.方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测.结果:标准曲线呈良好的线性关系.标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增.结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台.     

心理干预对隔离飞行学生的影响分析

目的探索在甲型H1N1流感病毒流行期间,被隔离飞行学生心理健康的干预效果。方法在对从美国疫区归国的37例学生实行医学隔离过程中给予集体晤谈和个别访谈,并在隔离期满3天时采用SAS和SDS自评量表进行测量,在隔离前后采用SCL-90症状自评量表测量。结果被隔离学生的心理健康水平高于全国大学生的心理健康水平（P〈0.05）;隔离后学生的心理健康水平高于隔离前学生的心理健康水平（P〈0.05）。结论良好的心理干预可以将危机事件转变成促进学生成长的资源。     

胡芦巴对Caco-2细胞NPC1L1基因的mRNA表达水平的影响

目的探讨胡芦巴的降脂机制,观察经胡芦巴水溶液处理后,Caco-2细胞中NPC1L1(胆固醇吸收的主要载体基因)的mRNA表达水平。方法将胡芦巴水溶液暴露于Caco-2细胞中24、42、48小时,未处理组作为对照组,从细胞中分离mRNA进行Real-Time PCR分析,采用ABI PRISM7000生物程序分析系统测定Caco-2细胞的NPC1L1的mRNA表达水平。结果经胡芦巴水溶液处理的Caco-2细胞NPC1L1的mRNA表达水平与对照组(未治疗组)相比降低47%。结论胡芦巴可降低Caco-2细胞的NPC1L1的mRNA表达水平。     

解毒祛瘀滋阴方对MRL／lpr小鼠粘附分子表达的影响

目的探讨解毒祛瘀滋阴方可能的作用机制。方法以MRL/lpr小鼠80只,分成4组采用RT—PCR技术检测各组肾组织ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平。结果解毒祛瘀滋阴方合用激素组ICAM-1和VCAM—1mRNA表达低于其他各组。结论解毒祛瘀滋阴方合用激素能有效降低MRL／lpr小鼠肾组织ICAM-1和VCAM—1mRNA表达水平。     

程序性死亡因子配体1修饰供者DC对大鼠异体胰岛移植存活的影响

目的探讨共刺激信号阻断剂PDL1基因修饰的树突状细胞(dendritic cells,DC)对胰岛移植存活的影响。方法以BN、Lewis大鼠为胰岛移植供、受体;用PDL1(程序性死亡因子配体1)基因重组腺病毒转染供、受体骨髓源性DC使之表达PDL1;将供、受体DC于胰岛移植前24h经股静脉分别注入受体(设为组1、组2),供、受体DC混合后注入受体(组3),注射生理盐水的为空白对照组(组4);观察各组糖尿病鼠高血糖改善情况及存活时间,术后第20天,MTT法检测受体脾细胞对供体及无关抗原刺激的反应。结果与对照组相比,组1和组3血糖维持正常时间和受体存活时间显著延长〔组1:(22.47±11.72)d和(41.25±12.98)d,P<0.01;组3:(37.67±14.71)d和(52.31±15.47)d,P<0.001)〕差异有统计学意义,组2移植胰岛存活时间无延长〔(3.75±1.33)d与(7.33±1.97)d,P>0.05〕差异无统计学意义。术后第20天,组1、组3脾细胞对供体抗原刺激的反应均明显低于正常对照(0.27±0.08和0.23±0.06与0.70±0.09,P<0.001),而对无关抗原刺激的反应与正常对照差异无统计学意义(0.66±0.07和0.66±0.07与0.69±0.05,P>0.05)。结论PDL1基因修饰的供体DC可以明显延长大鼠移植胰岛的存活时间,而受体DC则无此作用,但两种DC联合应用可以使移植胰岛获得更长的存活时间。     

新型甲型H1N1流感主要临床特征观察

目的了解2009年新型甲型H1N1流感的主要临床特征。方法依据国家卫生部甲型H1N1流感诊疗方案试行版第三版诊断,将1起以发热、咳嗽等上呼吸道感染症状为主的疫情暴发202例患者的症状、体征及其中62例住院患者的实验室检查及影像学检查结果进行统计,归纳此次新型甲型H1N1流感患者的主要临床特征。结果调查202例患者中,发热是最普遍的全身表现,其中低热52例占25．74％,中等程度发热99例占49．01％,高热51例占25．25％;局部症状中以咳嗽为最常见占77．23％;患者有乏力49．5％、头痛49．5％、头晕47．52％、咽痛47．52％、流鼻涕47．03％、鼻塞45．05％、打喷嚏40．59％;四肢酸痛和腰背酸痛分别占28．71％、36．63％;62例住院患者中外周血白细胞异常者14例,淋巴细胞异常者29例,肝功能ALT轻度升高6例,胸片有肺部感染者4例,心电图异常者2例。结论此次甲型H1N1流感的全身中毒症状主要以发热、乏力、头痛、头晕、四肢和腰背酸痛等为主,局部症状以咽痛、流鼻涕、鼻塞、打喷嚏为主,血常规可有异常,并发细菌感染时胸片异常,心脏、肝脏受累的较少。     

CYP1A1基因3'-UTR6235T-C位点多态性与维医分型乳腺癌遗传易感性的关系

目的 探讨细胞色素氧化酶p450(CYP)1A1基因3'-UTR(3'-非编码区)6235T-C位点多态性与新疆维吾尔自治区汉族人群异常体液型乳腺癌的相关性.方法 按维吾尔医学将乳腺癌患者分为4种体液型,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分子生物学技术对新疆汉族137例乳腺癌患者和148名健康对照组CYP1A1基因3'-UTR6235T-C位点多态性进行检测,比较各组间等位基因和基因型频率分布的差异.结果 (1)CYP1A1基因3'-UTR6235T-C位点3种基因型和两种等位基因分布频率在异常胆液质型乳腺癌患者组和健康对照组间比较差异有统计学意义(x2=8.790,P=0.012;x2=7.102,P=0.008),其中CC基因型和C等位基因在异常胆液质型乳腺癌患者组的分布频率(16.4%和39.8%)显著高于健康对照组(4.7%和25.7%).(2)CYP1A1基因3'-UTR6235T-C位点3种基因型和两种等位基因分布频率在异常黑胆质型乳腺癌患者组和健康对照组比较差异有统计学意义(x2=6.638,P=0.036;x2=5.824,P=0.016),其中TC、CC基因型和C等位基因在异常黑胆质型乳腺癌患者组的分布频率(56.9%,9.8%和39.2%)显著高于健康对照组(41.9%,4.7%和25.7%).结论 CYP1A1基因3'-UTR6235T-C位点CC基因型和C等位基因可能与新疆汉族维吾尔医异常胆液质型和异常黑胆质型乳腺癌的发病有关,可能与异常黏液质型乳腺癌易感性无关.

Abstract：

Objective To explore the association between polymorphism of cytochrome P450 1 Al Gene 3'-UTR (3'-untranslated region ) 6235T-C and breast cancer with abnormal Hilit in Chinese Han population of Xinjiang. Methods The breast cancer patients were divided into four body fluids according to Uighur medical theories. And the technique of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was employed to detect the genotypic and allelic frequencies of 6235T-C polymorphism situated in 3'-untranslated region of CYP1A1 gene in 137 breast cancer patients with abnormal Hilit and 148 normal control subjects in Han population of Xinjiang province. Results ( 1 ) Significant differences in the genotypic and allelic distribution frequencies of CYP1A1 gene 3'-UTR6235T-C were found between breast cancer patients with abnormal Sapra Hilit and controls ( x2 = 8. 790, P = 0. 012;x2 = 7. 102,P = 0. 008 ). The frequencies of CC genotype and C allele were significantly higher in breast cancer patients with abnormal Sapra Hilit ( 16. 4% vs 39. 8% ) than in controls ( 4. 7% vs 25. 7% ). ( 2 ) Significant differences in the genotypes and allelic distribution frequencies of CYP1A1 gene 3'-UTR6235T-C were found between breast cancer patients with abnormal Savda Hilit and controls ( x2 = 6. 638, P = 0. 036;x2 =5. 824, P =0. 016). And the frequencies of TC, CC genotypes and C allele were significantly higher in breast cancer patients with abnormal Savda Hilit ( 56. 9%, 9. 8%, 39. 2% ) than those of the controls (41.9%, 4.7%, 25.7%). Conclusion The CC genotype and C allele of 6235T-C polymorphism of CYP1Al may be linked with breast cancer with abnormal Sapra Hilit and abnormal savda Hilit in Chinese Hah population of Xinjiang province. But they are not correlated with the susceptibility to breast cancer with abnormal Balgham Hilit.