人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的：构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）/增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法：采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用Lipofectamine^TM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果：扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论：成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系的建立

目的 建立稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系.方法 下载BRP 44的全长mRNA序列,用Oligo 6进行引物设计,在上下游引物的5'引入相应的Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶识别序列及保护碱基.提取LNCaP细胞的总RNA反转录成cDNA进行PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His A中构建成重组体.重组载体经酶切和测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染PC-3细胞、G 418筛选、Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果 成功构建BRP 44的真核表达载体并获得高效稳定表达的BRP 44基因的PC-3细胞亚克隆.结论 高效稳定表达BRP44的PC-3细胞亚克隆可用于下一步研究.     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

鸟苷酸解离抑制因子-2 真核表达载体构建及稳定转染A549 细胞株 的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。     

MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

豚鼠MCHR2基因外显子1的克隆及序列分析

目的 探明豚鼠体内MCHR2基因的表达情况, 为构建动物模型提供实验依据.方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜豚鼠大脑组织的总RNA中扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,从豚鼠脑组织中提取基因组DNA,PCR扩增MCHR2基因外显子1的序列,克隆入pUCm-T载体后进行序列分析.结果 RT-PCR法未获得目的 片段;由基因组DNA扩增出的MCHR2基因外显子1的序列片段长183 bp,与GenBank登录的人、猴、白鼬、犬的MCHR2序列比对,在第47位后面多了一个碱基--A,由于移码错译而导致提前出现终止密码,从而缩短了预测的开放阅读框架.结论 豚鼠体内的MCHR2基因是无功能的假基因.     

pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2与其放射性配体结合的影响

目的 研究人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因特异的小发夹RNA(shRNA)真核表达载体(pGenesil-1-MCHR2-shRNA)对MCHR2与其放射性配体结合特征的影响.方法 将pGenesil-1-MCHR2-shRNA表达载体转染到稳定表达人MCHR2基因的中国仓鼠卵巢细胞CHO中,通过放射性配体结合实验(RBA)检测受体最大结合容量(Bmax)及平衡解离常数(Kd值)的变化.结果 与转染pGenesil-1空载体组比较,pGenesil-1-MCHR2-shRNA使Bmax减少39.4%～78.7%,Kd值升高40.9%～81.9%.结论 MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效减少Bmax、升高Kd值,为利用RNA干扰技术研究人MCHR2基因功能奠定良好的实验基础.     

稳定表达IL-8基因宫颈癌SiHa细胞株的建立及鉴定

目的 建立高效、稳定表达IL-8基因的人宫颈癌peDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株.方法 利用pcDNA3.1(+)真核表达载体构建pcDNA3.1/IL-8表达载体,利用基因克隆技术将IL-8 cDNA基因片段通过脂质体转染入人宫颈鳞癌SiHa细胞中,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,建立了高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa宫颈癌细胞株,转染阳性细胞连续传代培养,传8代后用RT-PCR,ELISA,免疫细胞化学法进一步鉴定细胞中IL-8的表达.结果 成功建立了持续高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株,并在细胞中检测到IL-8 mRNA及蛋白的高表达.结论 高效表达IL-8基因的SiHa细胞株的建立有助于研究IL-8基因在宫颈癌发生发展中的作用.     

稳定表达HBsAg的P815细胞株的建立及鉴定

目的:筛选并建立稳定表达亚洲人常见的adr亚型HBsAg的P815细胞株,为乙肝DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法:用PCR方法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pcDNA3载体,并通过脂质体转染P815细胞,G418筛选.结果:构建了重组质粒pcDNA3-HBsAg(S),转染细胞及其培养上清中均可检测到HBsAg(S)的存在,PCR扩增也证实HBsAg(S)基因已稳定整合于P815细胞的染色体中.结论:获得了稳定表达HBsAg的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测乙肝DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.     

稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立

目的：建立稳定表达缺失型DNA聚合酶β（polβ）的细胞系。方法：将已构建的缺失型polβ的真核表达载体pcDNA3．1-polβ用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定细胞缺失型polβmRNA的表达。结果与结论：成功转染和筛选出表达缺失型polβ细胞株CHO—polβ，建立了稳定表达缺失型polβ的CHO细胞株。     

稳定表达促血管生成素基因肝癌细胞系的建立及产物的检测

目的 构建携带促血管生成素(Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC7721，为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC7721，通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC7721肝癌细胞系，并用G418筛选稳定表达的细胞克隆，构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系，新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法，新细胞系的建立将为进一步的促血管生成素在肝癌血管的生成和转移中的作用研究奠定基础。     

稳定表达人细胞色素P450 1A2的HepG2细胞的建立及其代谢效应

目的：建立稳定表达人细胞的色素P450 1A2(CYP1A2)的HepG2细胞。方法：将所克隆的野生型CYP1A2 cDNA从重组质粒pGEM-CYP1A2中用Kpn Ⅰ／BamHⅠ双酶切，并亚克隆到哺乳动物细胞表达栽体pREP9中。再将重组质粒转化感受态大肠杆菌Top10，用氨苄青霉素抗性筛选和限制酶谱鉴定。改良的磷酸钙介导的细胞转染法将重组质粒pREP9-CYP1A2转染肝癌细胞HepG2，用RT-PCR技术对转基因细胞的CYP1A2mRNA表达作了分析，并用MTT法比较转基因细胞对黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒敏感试验。结果：与HepG2细胞相比，HepG2-CYP1A2转基因细胞表达CYP1A2 mRNA，能增强AFB1的细胞毒作用。结论：建立了稳定表达CYP1A2的转基因细胞系，可用于由CYP1A2参与的毒理学与药物代谢研究。