结核分枝杆菌higBA基因对细菌应激反应及胞内感染免疫机制的研究

  目的  探究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）higBA基因对细菌应激反应及胞内感染免疫的作用。  方法  从Mtb H37Rv基因组上扩增获得目的基因,与载体连接后电转化入耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms）构建重组菌,对空载菌 Ms_vec和重组菌 Ms_higBA进行应激实验和Raw264.7小鼠巨噬细胞感染实验,检测细菌菌落形成单位（CFU）和细胞因子白介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40,干扰素（interferon, IFN）-γ,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α和诱导型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase, iNOS ）的转录水平变化。  结果  成功构建Ms_higBA重组菌。应激实验结果表明higBA确能提高细菌在体外培养特定条件下的生存能力。胞内感染实验证明higBA能提高细菌在巨噬细胞内存活能力,影响细胞因子的转录水平。  结论  Mtb的higBA基因在细菌应激反应和胞内感染免疫中发挥了作用。     

结核分枝杆菌Rv3084编码酯酶LipR的生物学特性和体内免疫调节功能

  目的  探究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）Rv3084编码的酯酶LipR的生物学特性及其在体内的免疫调节功能。  方法  从MTB H37Rv标准毒力株扩增LipR基因,构建重组表达质粒;测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌,诱导LipR蛋白表达并纯化,Western blot鉴定;进行LipR酯酶活性检测,分析影响LipR酶活性的因素;将重组质粒于小鼠胫前肌肉注射0.1 mL（含质粒DNA 100 μg）3次（第1,8,15天）,末次注射后7 d,处死小鼠,取肺、脾脏进行细胞因子检测。  结果  成功构建重组表达质粒,并发现LipR蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,蛋白相对分子质量约为33×103;在标准水解活性实验条件（40 ℃,pH7.5）下,其最适水解底物为4-硝基苯基乙酸酯（pNPA,C2）;以4-硝基苯基丁酸酯（pNPB,C4）作为底物,测得LipR水解活性的最适pH值为8.5,最适反应温度为40 ℃,说明LipR是一种相对耐碱耐热的酯酶;而在不同的除垢剂或金属离子存在的环境下,LipR水解pNPB的活性受到一定程度地抑制。重组质粒注射小鼠后,发现LipR能抑制γ-干扰素（IFN-γ）和白细胞介素（IL）-2的分泌,但IL-10分泌量增加。  结论  酯酶LipR可能参与帮助MTB协同抵抗宿主内苛刻的环境,并充当免疫调节剂,抑制促炎细胞因子分泌。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

结核分枝杆菌Rv3432c蛋白的原核表达与生物信息学分析

目的 构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv3432c基因的原核表达质粒并进行体外表达,运用生物学信息学软件分析蛋白Rv3432c特征,探讨抗M.tb新型药物靶点。方法 以灭活的结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增Rv3432c基因,并与表达载体pET-28a构建原核表达重组质粒。SDS-PAGE分析表达产物并利用亲和层析的方法进行纯化。采用Protparam、Pfam online tool、SOMPA、Protscale、TMHMM、Signalp 6.0、NetPhos3.1、SUMOsp 2.0、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白Rv3432c的生物学特性。结果 pET-28a-Rv3432c重组质粒测序结果与目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性蛋白形式存在,相对分子质量约为55×10³,与预期大小相符。蛋白Rv3432c为亲水性蛋白(GRAVY值为-0.079)。蛋白Rv3432c为无跨膜结构域和信号肽的蛋白。Rv3432c二级结构主要由无规则卷...     

结核分枝杆菌GroEL基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的克隆结核分枝杆菌基因组携带的两组GroEL基因,即GroEL1和GroEL2,它们分别编码热休克蛋白HSP60（cpn60.1）和HSP65（cpn60.2）,并构建真核表达质粒。方法用带有EcoR I和Xba I酶切位点的特异性引物,从结核杆菌H37Rv株中PCR扩增两组GroEL基因,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2,并进行酶切和测序鉴定。结果成功克隆了结核分枝杆菌两组GroEL基因,酶切鉴定pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2构建成功,经DNA测序证实,载体上插入的序列与GenBank公布的序列一致。结论获得了结核分枝杆菌GroEL1和GroEL2基因,成功地构建了含GroEL1和GroEL2基因的真核表达质粒,为研究其作为核酸疫苗在免疫学方面作用提供材料。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target,ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP10）的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的 探讨基于特异常规引物（即引物不需折叠成特定二级结构）靶向恒温扩增重复DNA序列的方法，并测试其检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的可能性。方法 以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板，用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果 合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步，Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs）可用其特异常规引物对（即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R）或单引物（即Ⅱ_MIRU-F）进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株，Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高，且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论 常规引物可恒温扩增重复DNA序列（包括Mtb Ⅱ型MIRUs）；Mtb Ⅱ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。     

结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的 对结核杆菌新抗原一带信号肽的Mtb8．4（MS）进行基因克隆，构建其真核表达质粒并加以鉴定。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8．4（MS）目的基因，经HindⅢ和EcoRⅠ消化后，与pcDNA3．1（＋）载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1（＋）-MS真核表达质粒构建完成后。用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论 pcDNA3．1（＋）-MS真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该质粒的免疫保护效果，了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。     

结核分支杆菌重组蛋白rCFP-10的表达、纯化及免疫反应性分析

目的表达、纯化结核分支杆菌H37Rv株重组蛋白rCFP—10,评价其免疫反应性,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b—CFP-10转化E．coli表达菌株BL21（DE3）pLysE,IPTG诱导重组蛋白rCFP-10表达。经SDS—PAGE电泳和Westernblotting鉴定后,优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱HisTrap^TMHP纯化重组蛋白,最后用斑点金免疫渗滤法初步评价纯化蛋白的免疫反应性。结果成功构建了重组质粒pET23b—CFP-10并且重组蛋白rCFP-10以可溶性形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的10％。经亲和层析后得到高纯度有免疫反应性的重组蛋白（纯度约为98．5％）。结论高纯度有免疫反应性的重组蛋白rGFP-10为新型亚单位疫苗的研发及其结核病血清学诊断价值研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。     

用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备

目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性。三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价。结果成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上。三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度最高(0.02μg/L),稳定性最好。结论得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础。     

优化分枝杆菌重组工程系统构建分枝杆菌突变株筛选方法

  目的   通过为分枝杆菌重组工程系统(pJV53)加筛选标记,建立一种分枝杆菌突变株的筛选方法。   方法  为pJV53加入蔗糖反筛选基因SacB和突变的潮霉素抗性基因hygS,通过潮霉素抗性恢复指示耻垢分枝杆菌(Ms)体内同源重组的成功,为突变株的筛选提供标记;通过蔗糖反筛选挑选脱去质粒的突变株。   结果  成功构建重组质粒pJV53-SacB-hygS,筛选出MSMEG_4487 G188A突变株以及利福平耐药的Ms rpoB D516Y和Ms rpoB H526Q突变株,并成功将以上突变株脱去质粒。   结论  pJV53-SacB-hygS能够有效帮助构建筛选突变株,并对突变株进行脱质粒操作,具有普遍应用价值;结核分枝杆菌rpoB基因D516Y和H526Q的突变与该菌对利福平的耐药有关。     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

目的 选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白.方法 用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCK)的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位.根据本实验室之前对表面蛋白...     

绵羊李斯特菌为载体的结核多阶段T细胞表位疫苗的构建及评价

  目的  构建以绵羊李斯特菌（Listerria ivanovii,LI）为载体的表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。  方法  将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv。将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株。观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀）,以0.1×LD₅₀为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14 d的血清谷丙转氨酶（ALT）水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性。为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞水平。  结果  成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv。LI-msv 对C57BL/6小鼠的LD₅₀为3.3×108 CFU/只。通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7 d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ+ CD4+ T细胞和IFN-γ+ CD8+ T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高（P<0.005）;特异性TNF-α+ CD4+ T细胞比率高于相应载体对照组（P<0.01）和生理盐水对照组（P<0.005）,TNF-α+ CD8+ T细胞比率高于生理盐水对照组（P<0.005）。  结论  成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株。该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗候选株进行深入研究。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

Mycobacterium tuberculosis latency-associated antigen Rv1733c SLP improves the accuracy of differential diagnosis of active tuberculosis and latent tuberculosis infection

Background: Differential diagnosis of active tuberculosis (ATB) and latent tuberculosis infection (LTBI) has been a challenge for clinicians in high TB burden countries. The purpose of this study was to improve the accuracy of differential diagnosis of ATB and LTBI by using fluorescent immunospot (FluoroSpot) assay to detect specific Th1 cell immune responses. The novelmycobacterium tuberculosis (MTB) latency-associated antigens Rv1733c and synthetic long peptides derived from Rv1733c (Rv1733c S...