三七总皂苷对人根尖牙乳头干细胞增殖的影响

  目的  探究三七总皂苷（panax noto-ginseng saponins,PNS）对人根尖牙乳头干细胞（human stem cells from apical papilla, hSCAPs）增殖的影响。  方法  收集牙乳头组织、贴壁法分离培养原代细胞,流式细胞术鉴定hSCAPs表面标志物,诱导成骨及成脂鉴定hSCAPs多向分化潜能;配制25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的PNS培养基,CCK-8法检测不同浓度PNS下hSCAPs的增殖速率,流式细胞术检测最佳促进增殖组与对照组的细胞周期差异。  结果  原代分离培养成功的hSCAPs符合间充质干细胞来源,相关表面标记物高表达,可向成脂和成骨分化;与对照和其他实验组比较,25 mg/LPNS促进hSCAPs增殖效果最佳,差异具有统计学意义（P < 0.05）。  结论  25 mg/LPNS促进hSCAPs增殖能力的效果最佳,提示hSCAPs对PNS具有很强的敏感性。     

牙周膜干细胞BMP-2-PSH复合膜修复新西兰兔牙槽骨缺损

  目的  拟构建新西兰兔牙周缺损模型，确定hPDLSCs-BMP-2-PSH膜的生物安全性和其体内成骨修复作用。  方法  在确定BMP-2-PSH膜没有细胞毒性后将培养好的hPDLSCs细胞膜片复合至BMP-2-PSH膜上。分别在每只新西兰兔下颌左中切牙牙槽骨缺损内植入hPDLSCs/PSH复合膜作为实验组，右中切牙牙槽骨缺损内植入对照性多孔纤维膜材料作为对照组（或不植入任何材料作为对照），然后全瓣复位，缝合。术后即刻和每3周（连续观察12周）进行影像学（CT）检查，观察骨缺损愈合情况；同时，分别在术后第4、8、12周观察PDLSCs/BMP-2双膜材料的吸收度和各组样本新骨形成量和新骨形态。  结果  不同浓度PSH膜和BMP-2-PSH膜浸提液对hPDLSCs细胞不具有细胞毒性，hPDLSCs细胞能够成功复合到BMP-2-PSH膜上；CBCT及组织形态学分析显示，hPDLSCs/PSH复合膜能够有效促进牙槽骨缺损修复再生。  结论  hPDLSCs/PSH复合膜具有良好生物安全性，有利于修复新西兰兔牙周缺损。     

PVT1促进在胶质瘤C6细胞微环境中的BMSCs增殖和迁移

  目的  探讨与胶质瘤C6细胞间接共培养后骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和迁移能力的变化以及长链非编码RNA（lncRNA）浆细胞瘤变异异位基因1（plasmacytoma variant translocation 1 gene,PVT1）在这种变化中的作用。  方法  分离、培养、鉴定BMSCs后,采用Transwell小室将生长状态良好的BMSCs与胶质瘤C6细胞间接共培养（共培养组）,单独培养的正常BMSCs为对照组。CCK8及软琼脂克隆形成实验检测2组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,划痕实验及Transwell法检测细胞的迁移能力,实时定量PCR（qRT-PCR）检测PVT1基因的表达。在共培养组BMSCs中转染si-PVT1（si-PVT1组）和si-NC（si-NC组）,转染后重复上述检测,并增加qRT-PCR检测周期蛋白基因CyclinD1及迁移相关基因基质金属蛋白酶2、9（ MMP2、 MMP9）的表达。  结果  所用BMSCs具有成骨、成脂分化能力。与对照组相比,共培养组BMSCs体积变小,排列紊乱,细胞间接触抑制消失,增殖及迁移能力增强,S期及G₂期细胞比例增加,PVT1表达增加（P<0.05）。与si-NC组比较,si-PVT1组抑制共培养BMSCs的增殖及迁移能力,G₁期细胞比例增加,S期细胞比例减少,PVT1、CyclinD1及 MMP2、MMP9 mRNA表达也降低（P<0.05）。  结论  胶质瘤C6细胞微环境中BMSCs增殖及迁移能力增强可能与PVT1高表达有关。     

骨髓间充质干细胞外泌体促进大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移

  目的  探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells, BMSCs）外泌体正常状态下对大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移的影响。  方法  提取大鼠BMSCs并进行鉴定,将其与脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）通过Transwell小室共培养24 h（BMSCs共培养组）;提取BMSCs外泌体进行鉴定,荧光显微镜下定性观察细胞吞噬外泌体的行为,CCK8 法检测细胞活力选定最佳BMSCs外泌体工作浓度,将其与bEnd.3细胞共培养24 h（BMSCs外泌体共培养组）。另设bEnd.3细胞单独培养组。培养24 h后通过EDU和细胞划痕实验,分别检测以上3组bEnd.3细胞的增殖和迁移能力。  结果  第3代BMSCs表面CD90、CD29为阳性,CD45显示为阴性,可成骨、成脂,表明所提取的BMSCs纯度较高。透射电镜下BMSCs外泌体形态为类圆形,直径在100 nm左右;NTA分析发现BMSCs外泌体的直径分布范围为50～600 nm,其中粒径峰值为150 nm;免疫荧光显示内皮细胞能够吞噬BMSCs外泌体;CCK8显示20 μg/mL外泌体加入对细胞增殖影响达到最佳。EDU检测显示,相较于对照组,BMSCs共培养组、BMSCs外泌体共培养组均可促进bEnd.3细胞的增殖（P<0.05）,且促进增殖的能力相当（P>0.05）。细胞划痕实验示,BMSCs外泌体共培养组细胞的迁移率高于对照组（P<0.05）,但与BMSCs共培养组差异不明显（P>0.05）。  结论  BMSCs外泌体可代替BMSCs,有效促进脑微血管内皮细胞的增殖和迁移,并为卒中后的血管新生提供新的潜在治疗手段。     

自发和诱导分化产生的人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮补体H因子的表达

  目的  研究人胚胎干细胞（hESC）分别经自发分化和诱导分化产生的视网膜色素上皮细胞（RPE）表达及分泌补体替代通路调控蛋白补体H因子（CFH）的情况。  方法  将hESC分别按照临床试验中所采用的自发分化法和利用生长因子与小分子药物诱导分化的方法获得hESC-RPE，在第3代hESC-RPE培养至第4~5周后，采用实时荧光定量PCR和免疫荧光进行鉴定，酶联免疫吸附（ELISA）法检测CFH的分泌水平。对照组为ARPE-19细胞系。  结果  hESC通过自发分化和诱导分化均可获得在细胞形态及特异性基因表达方面与人原代RPE高度相似的细胞。自发分化产生的视网膜色素上皮细胞（sdRPE）和诱导分化产生的视网膜色素上皮细胞（iRPE）的CFH mRNA相对表达量均高于对照组ARPE-19细胞系（P<0.05）。在24 h、48 h和72 h的条件培养基中，sdRPE组的CFH分泌量高于iRPE组（P=0.000 2），且sdRPE和iRPE均高于ARPE-19细胞系（P<0.000 1）。  结论  两种分化方式来源的hESC-RPE均可表达并分泌CFH，提示hESC-RPE可能具有一定的调控补体替代通路的能力。     

不同代次诱导多能干细胞增殖及牙周定向分化的能力

目的： 研究不同代次诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）在增殖及向牙周定向分化能力上的区别，为今后深入研究和可能的临床应用提供理论基础。方法：复苏不同代次（P5、P10、P15、P20）人牙龈成纤维细胞来源的iPSCs，观察细胞形态并比较其增殖能力,进一步将各代次细胞形成拟胚体，于含生长分化因子-5（growth/differentiation factor-5, GDF-5）的培养基中诱导分化14 d，同时分别设置未诱导自发分化组为阴性对照，茜素红染色观察矿化结节并半定量分析钙盐沉积量，qRT-PCR及免疫荧光染色分别检测牙周相关基因及蛋白的表达，评价各代次间分化能力的差异。结果：不同代次的iPSCs均具有很强的体外增殖能力，经牙周定向诱导的细胞呈成纤维细胞样生长，茜素红染色可形成“矿化”结节，细胞钙盐沉积量较自发分化组显著增高且差异有统计学意义（P5：t=2.125，P=0.003；P10：t=2.246，P=0.021；P15：t=3.754，P=0.004；P20：t=3.933，P=0.002），但相同诱导条件下不同代次间钙盐沉积量差异无统计学意义（牙周定向诱导组：F=2.365，P = 0.109；自发分化对照组：F=2.901，P=0.067）,此外，相同代次细胞中诱导组牙周相关标记物的表达均高于对照组且差异有统计学意义（P<0.05），但不同代次间的蛋白表达差异无统计学意义（骨涎蛋白：F=0.9267，P=0.450；波形蛋白：F=0.9171，P=0.455；牙骨质蛋白1：F=2.129，P=0.137）。结论：不同代次不会影响iPSCs的增殖及分化能力，体外长期培养的iPSCs易于扩增，较高代次者经诱导仍可高效定向分化，适合作为牙周组织工程的种子细胞。     

UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

  目的  观察泛素样含PDH和环指域1 (UHRF1)对雌激素受体（ER）α和ERβ表达比率的影响,探讨UHRF1影响甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移的机制。  方法  应用Western blot、实时荧光定量（qRT）-PCR检测正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞BCPAP中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白及mRNA表达。分别用Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA处理BCPAP细胞,qRT-PCR检测各组细胞中ERα和ERβ的mRNA表达;MTT、Transwell分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。  结果  与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP细胞中UHRF1和ERα蛋白及mRNA表达水平上调（P<0.05）,而ERβ蛋白和mRNA表达水平下调（P<0.05）。与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞中ERα mRNA表达降低（P<0.05）,ERβ mRNA表达升高（P<0.05）;转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移降低（P<0.05）。  结论  UHRF1可上调ERα/ERβ的表达比率,促进甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移。     

骨形态发生蛋白2／7异二聚体对人脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨新型成骨诱导生长因子骨形态发生蛋白2/7异二聚体（bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer,BMP-2/7）在诱导人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化中的作用。方法：体外培养hASCs,以成骨诱导培养基（osteogenic medium,OM）中添加150 μg/L BMP-2/7为实验组,以单纯OM为阳性对照组（OM组）, 以常规增殖培养基（proliferation medium,PM）为阴性对照组（PM组）。体外诱导的第1、4和7天检测细胞DNA含量,第7和14天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,第21和28天进行茜素红染色及定量检测,第1、4、7和14天分别进行成骨相关基因的检测。体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：（1）单纯β 磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架（支架对照组）;（2）β-TCP支架+hASCs（体外PM培养1周）（增殖细胞对照组）;（3）β-TCP支架+hASCs（体外OM培养1周）（诱导细胞对照组）;（4）β-TCP支架+hASCs（体外OM+150 μg/L BMP-2/7培养1周）（实验组）。植入后4周进行取材,标本制成组织学切片,进行HE和Masson三色染色分析。结果：体外诱导后第1天,实验组细胞DNA含量与PM组差异没有统计学意义（P>0.05）,第4天时实验组细胞DNA含量较PM组升高（P<0.05）,第7天时组间DNA含量没有明显差异（P>0.05）。诱导7天和14天后,实验组的ALP染色及定量检测均高于OM组和PM组（P<0.05）;第21和28天矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于OM和PM组（P<0.05）。诱导第1天时实验组的成骨相关基因（Runx2、ALP、COL-1A1）的表达量即高于PM组 (P<0.05),诱导第4天时骨钙素（osteocalcin,OC）基因表达量即开始升高,第4、7和14天的基因表达量较OM和PM组显著升高（P<0.05）。HE染色分析可见实验组和诱导细胞对照组的hASCs能分泌出嗜酸性较强的均质细胞外基质,出现了强嗜酸性的类骨组织;与诱导细胞对照组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型;其他两对照组均未见矿化基质和类骨组织生成。Masson三色染色分析可见实验组呈强阳性表现,细胞基质中充满绿染的胶原;诱导细胞对照组和增殖细胞对照组的细胞基质中有不同程度的阳性表现,但较之实验组,胶原的数量明显减少;单纯支架组未见胶原的表达。结论：BMP-2/7在hASCs的成骨分化过程中发挥了重要作用,能够有效促进hASCs的体外和体内成骨分化。     

下调表达SND1通过调控衰老相关分泌表型促进人二倍体成纤维细胞衰老的研究

  目的  研究下调表达葡萄球菌核酸酶和tudor结构域1(staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1, SND1) 对人二倍体成纤维细胞衰老的影响,并探讨其相关机制。  方法  Western blot和免疫组化分别检测SND1在年轻及衰老2BS细胞（博来霉素诱导2BS细胞老化）和老年组织（人结肠腺瘤组织）中的表达情况;免疫荧光检测SND1在年轻2BS细胞中的定位;CCK8和EDU分析检测2BS的增殖能力;集落形成分析评价2BS集落形成能力;表达芯片和RT-qPCR分析衰老相关分泌表型（SASP）表达改变;β半乳糖苷酶染色用于显示衰老的2BS细胞。  结果  SND1在衰老2BS细胞中的表达较年轻2BS细胞显著下调,且在人结肠腺瘤组织中的表达较非病变结肠组织明显下调。在年轻的2BS中,敲低SND1抑制2BS增殖和克隆形成,并出现增强的衰老相关β半乳糖苷酶染色(P<0.05)。表达芯片检测结果和RT-qPCR分析表明敲低SND1上调了SASP成分(P<0.05)。  结论  本研究结果表明下调的SND1通过上调SASP表达来调控人二倍体细胞衰老。     

葛根素对牙周炎大鼠Th17/Treg细胞免疫平衡及相关转录因子表达的影响

目的 探究葛根素对牙周炎大鼠辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)/调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）免疫平衡及相关转录因子的影响。方法 采用分离牙龈、丝线结扎配合龈下注射大肠杆菌内毒素（ELPS）法建立大鼠牙周炎模型。将大鼠随机分为正常对照组（A组）、牙周炎模型组（B组）、200 mg/（kg·d）葛根素组（C组）。HE染色观察牙周组织病理形态学变化。通过Micro-CT对骨生物学参数定量分析牙槽骨吸收情况。流式细胞术、免疫印迹法（western blot,WB）分别检测牙周组织中Th17、Treg细胞比例、白介素-17(IL-17)、视黄酸相关孤儿受体（RORγt）、IL-10、叉头状转录因子-3(Foxp3)蛋白表达。结果 HE染色中葛根素组大鼠牙根部可见明显新生骨细胞增生,牙周膜可见少量炎症细胞聚集,牙槽骨结构较整齐。Micro-CT显示治疗组大鼠牙槽骨较模型组骨量略有下降,骨质量及强度有所上升。流式细胞术检测全血细胞发现葛根素组的TH17、Treg细胞比例均下降,且TH17/Treg的细胞比例也下降。IL-10、Foxp3在...     

牙周病患者唾液代谢轮廓分析

目的 利用代谢组学研究方法分析牙周炎患者唾液代谢轮廓,探讨牙周疾病相关代谢模式。方法 采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术结合主成分分析（PCA）法和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）法,分别对牙龈炎患者、牙周炎患者和健康人群各10例唾液样本进行代谢组学研究,分析代谢轮廓迁移和牙周疾病进程相关性。结果 牙龈炎患者、牙周炎患者和健康人群的唾液代谢轮廓存在明显差异,其中花生四烯酸、酪胺、L-精氨酸、胸腺嘧啶、N-乙酰氨基半乳糖硫酸盐、前列腺素E2、L-苯丙氨酸和5-氨基咪唑-4甲酰胺核苷酸（AICAR）等8个代谢产物在各组间差异显著。与健康人相比,AICAR在牙龈炎患者和牙周炎患者体内浓度较低,代谢趋势下调,其余代谢物的趋势均上调。结论 唾液代谢谱随牙周病进程而变化,牙周病相关病原微生物和牙周组织代谢异常是牙周疾病发生发展和预后的机制之一。     

木犀草素通过调控内质网应激抑制平滑肌细胞的迁移

  目的  研究木犀草素对人主动脉平滑肌细胞迁移的调控作用,并探讨其调控作用是否通过激活内质网应激途径实现。  方法  体外培养人主动脉平滑肌细胞,分为空白对照组（不做任何处理,BC）、阴性对照组（加等量无关试剂,NC）、木犀草素组（25 μmol/L处理）、木犀草素+4-苯基丁酸钠共处理组（4-苯基丁酸钠预处理后加入等量木犀草素）,于12h小时后细胞划痕实验法检测人主动脉平滑肌细胞迁移情况,Western blot和RT-qPCR检测BIP、CHOP蛋白及RNA表达水平。  结果  （1）与空白对照组和阴性对照组相比,木犀草素组细胞迁移水平明显降低,BIP、CHOP表达水平明显增高;（2）与木犀草素组相比,木犀草素+4-苯基丁酸钠共处理组细胞迁移水平增强,同时BIP、CHOP表达水平降低。  结论  木犀草素通过上调内质网应激抑制人主动脉平滑肌细胞的迁移。     

七氟烷抑制宣威肺癌XWLC-05细胞生物学行为

  目的   了解七氟烷对宣威肺癌细胞XWLC-05增殖、迁移、侵袭及恶性行为的影响，并进一步探讨其潜在机制。  方法   七氟烷对XWLC-05细胞进行处理，体外实验检测XWLC-05细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭变化；体内实验检测XWLC-05细胞致瘤性，蛋白印迹法分析增殖关键分子PI3K/AKT、细胞侵袭蛋白MMP-2/MMP-9的表达。  结果  对照组的克隆形成数（287.5±23.1）个，高于实验组（174.1±16.3）个，（P < 0.05）；对照组的凋亡率（1.60±0.38）%，低于实验组（31.48±5.81）%，（P < 0.01）；对照组迁移细胞数（87.8±10.2）%，高于实验组（35.2±4.4）%，（P < 0.05）；对照组侵袭细胞数（93.6±7.3）个，高于实验组（30.7±3.2）个，（P < 0.01）。七氟烷处理下调增殖蛋白分子PI3K、p-AKT和侵袭蛋白分子MMP-2、MMP-9的表达水平（P < 0.05）。  结论   七氟烷通过抑制PI3K/AKT信号通路降低宣威肺癌细胞XWLC-05的增殖能力，诱导细胞凋亡，减弱XWLC-05细胞的迁移、侵袭和成瘤能力。七氟烷可能成为宣威肺癌治疗的一种新方法。     

天然活性化合物松萝胺的毒理学安全性评价

  目的  探讨天然活性化合物松萝胺[C18H17NO6，6-乙酰基-2-（1-氨基-亚乙基）-7，9-二羟基-8，9b-二甲基-9bH-二苯呋喃-1，3-二酮]的使用安全性。  方法  选用SPF级小鼠进行小鼠经口毒性试验、体内外染色体畸变试验、骨髓微核试验、精子畸形试验及30 d喂养试验。  结果  研究条件下，实验小鼠急性经口毒性最大耐受剂量（MTD）大于15000 mg/kg；体内外染色体畸变试验均为性（P > 0.05）；骨髓微核试验结果为阴性（P > 0.05）；精子畸形试验结果为阴性（P > 0.05）；30 d喂养试验未见实验小鼠出现明显中毒体征，各项指标正常。  结论  松萝胺安全，无急性、亚急性中毒作用，无遗传毒性。     

三七总黄酮抗糖皮质激素诱发骨质疏松的效应

  目的  研究三七总黄酮拮抗糖皮质激素诱发骨质疏松的效应及可能的机制。  方法  将50只体重约170 g的SPF级雌性SD大鼠随机分为五组（10只/组），即正常对照组、模型组（激素组）和三七总黄酮高、中、低剂量治疗组（激素 + 用药组）。模型组和三七总黄酮治疗组采用地塞米松（2.5 mg/kg）肌肉注射，每周2次；同时三个治疗组分别给予三七总黄酮275 mg/（kg·d）、137.5 mg/（kg·d）、68.75 mg/（kg·d）灌胃治疗，每天1次。实验期9周。9周后测定各组大鼠股骨骨密度、反映骨生物力学性能的指标及血清生化指标。  结果  与正常组比较，模型组大鼠股骨骨密度（BMD）、骨生物力学性能、血清钙水平明显降低，血清磷水平及血清碱性磷酸酶活性明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，三七总黄酮高、中剂量治疗组大鼠股骨BMD、骨生物力学性能、血清钙水平明显增高，血清磷水平及血清碱性磷酸酶活性明显降低（P < 0.05）。  结论  三七总黄酮可提高糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨密度，改善其骨生物力学性能，对糖皮质激素诱发的骨质疏松具有拮抗作用，作用机制与其抑制骨吸收及糖皮质激素诱导的钙磷代谢失衡有关。     

建立稳定敲减MAP4K4表达的A549细胞系及初步分析

目的 分析敲减MAP4K4表达对癌细胞增殖及迁移运动的影响,并探究潜在的分子机理。方法 构建稳定敲减MAP4K4表达A549细胞,并综合免疫荧光、细胞增殖与迁移运动等实验方法,检测其亚细胞定位,并分析对照组与敲减组细胞增长及迁移运动变化情况。结果 A549细胞中MAP4K4定位于黏着斑及细胞边缘部位,稳定敲减MAP4K4表达诱导癌细胞成簇生长,阻滞细胞周期进程及细胞迁移运动。进一步分析发现,敲减MAP4K4表达诱导E-cadherin积累而下调N-cadherin,扰乱“钙黏蛋白转换”及上皮-间质转换。最终,对照组与敲减组细胞分别联合顺铂（终浓度为5μmol/L）及紫杉醇（终浓度为20 nmol/L）处理,稳定敲减MAP4K4表达可明显增强化疗药物对癌细胞的杀伤效果。结论 A549细胞中MAP4K4可通过调控“钙黏蛋白转换”促上皮-间质转化而调控癌细胞恶性表型及化疗耐药。