沉默TGFA抑制肝癌细胞增殖的研究

目的　探索siRNA 沉默TGFA 后对肝癌细胞增殖的影响。方法　将TGFA-siRNA 转染至L02 和HepG2 细胞中,Real-time PCR 检测TGFA mRNA 表达效率,Western blot 检测TGFA 的蛋白表达水平;MTT和BrdU 法检测沉默TGFA 后L02 和HepG2 细胞增殖的变化,Western blot 检测TGFA/EGFR 通路的活性;Real-time PCR 检测肝癌组织中TGFA 与EGFR 的mRNA 表达并分析其相关性。结果　在L02 和HepG2 细胞中,TGFA-siRNA 可下调TGFA 的表达,对肝癌细胞增殖有抑制作用而不影响正常肝细胞增殖,并可抑制TGFA/EGFR 通路活性。肝癌组织标本中TGFA 与EGFR 的mRNA 均高表达且呈正相关。结论　沉默TGFA基因可抑制肝癌细胞HepG2 的增殖。     

钠钾泵抑制剂通过调节细胞周期相关蛋白的生成介导肝癌HepG2细胞周期S期阻滞与凋亡

目的研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)和华蟾毒配基(cinobufogenin)对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及细胞周期的改变,初步分析其机制。方法以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,MTT比色法检测哇巴因和华蟾毒配基对HepG2细胞增殖的影响;Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR和Western blot检测CyclinA1、CDK2、PCNA和p21CIP1表达的变化。结果哇巴因和华蟾毒配基可明显抑制HepG2细胞增殖,抑制作用呈时间-浓度依赖性。荧光染色显示药物处理24h后,细胞呈现典型的凋亡形态特征;细胞周期分析显示,实验组S期细胞比例升高,实时定量PCR和Western blot结果显示:哇巴因和华蟾毒配基可下调CyclinA1、CDK2和PC-NA的表达(P<0.05),上调p21CIP1的表达(P<0.05)。结论钠泵抑制剂可抑制肝癌HepG2细胞的增殖,引起细胞周期S期阻滞,诱导细胞凋亡,这与其调节细胞周期相关蛋白的生成关系密切。     

多胺衍生物NNIspm诱导肝癌细胞HepG2衰老及其分子机制

探讨多胺衍生物NNIspm诱导肝癌细胞HepG2衰老及其分子机制。采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老; 应用高内涵活细胞成像系统检测细胞内NNIspm含量, 细胞周期分布以及细胞内活性氧水平; Western blotting检测蛋白的表达水平; 应用高效液相色谱法检测细胞内多胺含量的变化。结果表明: NNIspm可明显诱导HepG2细胞发生衰老, 这与其降低细胞内多胺含量, 诱导细胞周期阻滞于G₀/G₁期、增加细胞内活性氧有关。此外, 检测到衰老标志蛋白p21的表达明显增加; 相反, Cyclin E和CDK2的表达明显减弱。本研究结果表明: NNIspm引起的细胞衰老是其产生抗肿瘤作用的机制之一。     

葫芦素E通过诱导G_2/M周期阻滞抑制人肝癌细胞增殖

目的研究葫芦素E(cucurbitacin E,CuE)体外对人肝癌BEL7402和HepG2细胞的增殖抑制作用及机制。方法MTT法检测不同浓度CuE体外对BEL7402和HepG2细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测CuE对细胞周期分布的影响;Western blot法检测CuE对细胞周期调节蛋白cy-clinB1、Cdc25C、Cdk1及p21表达的影响。结果CuE作用72 h可剂量依赖性地抑制BEL7402和HepG2细胞增殖;CuE(100 nmo.lL-1)作用12、24 h后可使BEL7402和HepG2细胞周期阻滞于G2/M期,并可下调Cdk1蛋白的表达,上调p21蛋白的表达。结论CuE体外可抑制人肝癌BEL7402和HepG2细胞的增殖,其增殖抑制作用与诱导G2/M周期阻滞有关。     

常山酮抑制肝癌HepG2细胞活性及机制初步研究

探讨常山酮(halofuginone)抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞活性的作用及机制。以肝癌HepG2细胞为主要研究对象,使用CCK-8法、Transwell法、流式细胞术检测不同浓度和时间处理下,常山酮对HepG2细胞活性、细胞迁移、细胞周期和细胞凋亡的影响。通过实时荧光定量PCR (qPCR)和Western blot检测常山酮处理后细胞中柠檬酸合酶(citrate synthase, CS)、酮戊二酸脱氢酶(ketoglutarate dehydrogenase, OGDH)和异柠檬酸脱氧酶(isocitrate deoxygenase, IDH)的表达水平。与空白组相比,常山酮显著抑制HepG2细胞活性(P <0.01),降低HepG2细胞迁移率(P <0.01),诱导肝癌HepG2细胞凋亡(P <0.01),促使HepG2细胞周期停滞在S期(P <0.01)。常山酮处理后肝癌HepG2细胞中三羧酸循环关键酶CS、IDH3和OGDH表达量上调,异柠檬酸脱氢酶同工酶IDH1和IDH2表达量下调。常山酮可抑制肝...     

雷公藤红素激活AMPK信号通路抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用研究

摘要：目的:研究雷公藤红素（celastrol, Cel）抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用并探讨其作用机制。方法:CCK-8法检测不同浓度(0.5,1,2.5,5,10,25,50μmol·L-1)Cel抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用;流式细胞术检测不同浓度(1,2.5,5μmol·L-1) Cel对肝癌HepG2细胞周期分布的影响;Western blot法检测Cel对肝癌HepG2细胞中周期蛋白依赖性激酶2 （CDK2）、周期素A2抗体（Cyclin A2）等增殖相关蛋白和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα, Thr172）、固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）、脂肪酸合酶（FASN）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）等脂代谢相关蛋白表达的影响;在蛋白激酶B（Akt）/原癌基因c-Met过表达肝癌HepG2细胞中运用AMPK抑制剂Dorsomorphin （Compound C）干预,确证Cel抑制肝癌HepG2细胞增殖的机制。结果:Cel对肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用,且具有剂量-时间依赖效应;与对照组比较,不同浓度(1,2.5,5μmol·L-1) Cel能够阻滞肝癌HepG2细胞周期于S期,并显著降低CDK2、Cyclin A2等细胞周期调控蛋白表达水平;同时,Cel能够升高p-AMPKα（Thr172）蛋白表达水平,降低SREBP-1、FASN、ACC等脂代谢关键蛋白的表达水平;在Akt/c-Met过表达肝癌HepG2细胞中,Cel同样能够激活p-AMPKα（Thr172）并降低SREBP-1、FASN、ACC、CDK2、Cyclin A2等脂代谢与增殖相关蛋白的表达水平,但是运用AMPK抑制剂干预后能够逆转Cel对HepG2细胞脂代谢及增殖相关蛋白表达的影响。结论:Cel可能通过激活AMPK信号通路抑制脂代谢及增殖信号活化从而抑制肝癌HepG2细胞增殖。     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

ZNF300基因在肝癌耐药细胞HepG2/VCR中的表达及功能初探

目的建立人肝癌HepG2/VCR耐药细胞株,检测ZNF300基因在HepG2/VCR中的表达并初步分析其在肝癌多药耐药(MDR)中发挥的功能。方法采用体外低浓度梯度递增的诱导方法建立长春新碱(VCR)获得性HepG2/VCR耐药细胞株。MTT法检测确定HepG2/VCR耐药细胞株对VCR的耐药性,用Western blot方法检测人锌指蛋白ZNF300基因编码的ZNF300及多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)在HepG2和HepG2/VCR细胞中的表达差异;在HepG2/VCR细胞中转染ZNF300基因正向或反向cDNA质粒后,MTT法检测VCR对耐药细胞IC50值的变化,Westernblot方法检测细胞内P-gp表达的影响。结果 MTT检测确认HepG2/VCR耐药细胞构建成功,Western blot检测发现耐药细胞中ZNF300及P-gp的表达相对于HepG2细胞明显增高。在HepG2/VCR细胞中转染正向ZNF300 cDNA质粒后,MTT和Western blot检测发现ZNF300过表达可使VCR对耐药细胞的IC50值增高,并使细胞内P-gp表达上调;在转染反向cDNA质粒Knockdown ZNF300基因表达后得到相反的结果。结论 ZNF300基因在HepG2/VCR耐药细胞中表达明显增高,并能通过上调耐药蛋白P-gp的表达促进肝癌细胞耐药性,可以作为逆转肝癌多药耐药的分子作用靶点。     

HBx-siRNA 下调 HepG2．2．15细胞中血管内皮生长因子的表达

目的：研究 HBx干扰质粒pSIHBV/X对肝癌细胞HepG2．2．15中VEGF表达的影响。方法将针对HBx基因的干扰质粒载体pSIHBV/X转染HepG2．2．15细胞,用Real-time PCR检测转染前后细胞 HBx、VEGF基因 mRNA 表达,Western blot法检测细胞 VEGF蛋白表达。结果Real-time PCR检测结果显示,转染后24 h、48 h、72 h实验组 HepG2．2．15细胞中 HBx基因mRNA相对表达水平分别为（121．13±8．72）、（83．17±7．930）、（56．33±6．17）;24 h、48 h、72 h实验组HepG2．2．15细胞中 VEGF基因 mRNA 相对表达水平分别为（76．26±7．16）、（59．17±6．420）、（42．17±4．33）;Western blot检测结果显示,24 h、48 h实验组 HepG2．2．15细胞中VEGF蛋白相对表达水平分别为（0．357±0．025）、（0．218±0．051）。Western blot及RT-PCR结果显示,与对照组相比实验组中VEGF mRNA 及蛋白的表达量明显下调,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论靶向HBx的siRNA干扰质粒能抑制 HepG2．2．15细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达。     

麦冬皂苷B诱导人肝癌HepG2细胞自噬的分子机制研究

目的:研究麦冬皂苷B诱导人肝癌HepG2细胞自噬的分子机制.为临床抗肿瘤治疗提供理论依据.方法:MTT比色法检测人肝癌HepG2细胞增殖;流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡及细胞周期变化;吖啶橙、Lyso-Tracker Red(溶酶体红色荧光探针)染色、HepG2-GFP-LC3转染细胞等检测细胞自噬;Western blotting(蛋白质印迹法)检测人肝癌HepG2细胞自噬信号通路中关键蛋白的变化.结果:人肝癌HepG2细胞的增殖被麦冬皂苷B抑制,而且麦冬皂苷B可诱导人肝癌HepG2细胞发生自噬,但不诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,可导致LC3I转变为LC3II和Beclin-1(自噬标志性蛋白)表达增加,自噬抑制剂3-MA几乎完全逆转其抗增殖作用.Western blotting检测结果表明,AKT、mTOR和p70S6K的磷酸化及PTEN上调是被麦冬皂苷B抑制的结果.结论:麦冬皂苷B通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导人肝癌HepG2细胞发生自噬.     

乙肝病毒x蛋白结合蛋白抑制阿霉素诱导HepG2细胞凋亡的机制研究

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白结合蛋白(hepatitis Bvirus x-interacting protein,HBXIP)抑制阿霉素(doxorubicinhydrochloride,DOX,adriamycin,ADM)诱导HepG2肝癌细胞凋亡的作用及可能的分子机制,为研究肝细胞癌的临床耐药性奠定基础。方法以建立的稳定高表达HBXIP基因的HepG2细胞系为研究对象,分别用不同浓度的DOX处理高表达HBXIP组及对照组细胞,MTT法检测细胞的生存率,DAPI染色及Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡,免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果 MTT结果表明,DOX能够抑制HepG2细胞的存活,但HBXIP对DOX诱导的HepG2细胞凋亡作用具有明显的拮抗效应,并抑制DOX诱导的caspase-3、caspase-9及其底物PARP的活化,同时促进Bcl-2蛋白的表达。结论 HBXIP蛋白能够抑制化疗药物DOX诱导的HepG2细胞凋亡,其机制可能与调节胱天蛋白酶家族关键因子的活性相关。     

趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在肝癌侵袭 转移中的作用及机制

目的 探讨趋化因子受体 CXCR4 及其配体 CXCL12（CXCL12/CXCR4）在原发性肝癌侵袭转移中的作用 及机制。方法 分别采用 Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 等方法检测 60 例肝癌及对应癌旁组织标本中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平。常规培养 4 种肝癌细胞（Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B）和正常肝细胞 （7702）,Real-time PCR 检测上述细胞中 CXCL12、CXCR4 mRNA 的表达,筛选合适的实验细胞。将 CXCR4 干扰质 粒（sh-CXCR4）和对应空载体（sh-control）分别转染至 MHCC97h 构建稳转细胞系。Transwell 侵袭实验、细胞划痕实 验、MTT 实验分别检测 2 组细胞的侵袭、迁移和增殖能力。取稳定表达的 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞, 接种至 6 只裸鼠皮下,观察瘤体生长情况。Western blot 检测 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞及对应裸鼠移 植瘤中血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的表达,同时对转染 CXCR 过表达质粒的 MHCC97h 中 VEGF-C 的表达水平 进行检测。结果 （1）Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 的结果均证实肝癌组织中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平均高于癌旁组织。（2）Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B 细胞中 CXCL12/CXCR4 mRNA 表达水平均高 于 7702 细胞,选取 MHCC97h 为实验细胞。转染 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的侵袭、迁移和增殖能力均明显低于 sh-control 组,同时接种含 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的裸鼠移植瘤的生长速度也明显小于 sh-control 组。（3）体外 和体内实验均证实 sh-CXCR4 组的 VEGF-C 表达水平均低于 sh-control 组,而过表达 CXCR4 后,VEGF-C 的蛋白表 达明显上调。结论 CXCL12/CXCR4 在原发性癌组织和肝癌细胞中呈现高表达,CXCL12/CXCR4 可能通过调控 VEGF-C 蛋白表达从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。     

慢病毒介导的microRNA-155过表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响

摘要： 目的 通过构建慢病毒 （LV） 介导的miRNA-155 （miR-155） 过表达载体， 探讨上调miR-155对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。方法 针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP， 将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载体转染HepG2细胞， 建立稳定过表达miR-155的细胞系。细胞设过表达组 （H组）、 阴性对照组 （negative control， NC组） 和正常组 （normal， N组）。实时荧光聚合酶链式反应 （qRT-PCR） 方法检测各组miR-155和PTEN的表达水平； Western blot检测各组PTEN、 CyclinD1、 CyclinA1+A2蛋白表达情况； 细胞增殖-毒性检测 （CCK-8） 细胞增殖情况。结果 H组miR-155表达量明显高于其NC组及N组， 靶基因PTEN的表达量低于NC组及N组 （均P＜0.05）。H组PTEN蛋白的表达量明显低于NC组和N组， 而CyclinD1、 CyclingA1+A2蛋白的表达量明显高于NC组和N组 （均P＜0.05）。CCK-8结果显示3组12 h时吸光度值开始出现差异， 24 h、 48 h、 72 h H 组吸光度值均明显大于NC组和N组 （P＜0.05）， 但后2组差异无统计学意义。结论 过表达miR-155可促进肝癌细胞系HepG2细胞增殖。     

海蓬子皂苷甲调控SHP/STAT信号通路抗肝癌的研究

目的研究海蓬子皂苷甲(bigelovii A,BA)诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法使用MTT实验检测BA对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析BA对细胞凋亡的影响;Western blot分析p-STAT3、STAT3、p-STAT5、STAT5、SHP-1、SHP-2的表达。结果20和40μmol·L^-1 BA可诱导HepG2细胞发生凋亡,具有剂量依赖性。10、20和40μmol·L^-1 BA可抑制IL6诱导的STAT3和STAT5磷酸化,但酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠可逆转该抑制作用,且20μmol·L^-1 BA能激活蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。结论BA可能通过SHP-1/SHP-2和STAT3/STAT5通路诱导HepG2细胞凋亡。     

人剪切修复基因XPD对p52和p21基因的影响

目的:探讨人剪切修复基因XPD转染人HepG2肝癌细胞后p52和p21基因表达的变化以及对肝癌细胞生长的影响。方法:人肝癌细胞HepG2为靶细胞,XPD基因通过Lipofectamine2000脂质体转染HepG2。将细胞分为重组质粒HepG2-pEGFP-N2-XPD组(XPD组)、空载质粒HepG2-pEGFP-N2组(N2组)和HepG2空白对照组。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Westernblot)法检测各组细胞中XPD、p52以及p21的mRNA和蛋白质的表达量,并用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测各组细胞的增殖能力。结果:XPD组中的p52的mRNA表达较其他2组显著下调,XPD、p21的mRNA表达较其他2组明显上调(均P<0.01)。Westernblot检测结果显示各组细胞中XPD、p52及p21的蛋白表达各组间差异与其mRNA各组间差异一致。MTT检测显示XPD转染入HepG2后细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可以抑制癌细胞的生长和基因p52的表达,促进p21的表达。     

Hepatitis B virus X protein promotes hepatoma cell proliferation via upregulation of MEKK2

Aim:

To investigate the mechanism underlying the increase of hepatoma cell proliferation by hepatitis B virus X protein (HBx).

Methods:

HepG2, H7402 and HepG2.2.15 cells, which constitutively replicated hepatitis B virus were used. The effects of HBx on hepatoma cell proliferation were examined using 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) incorporation assay and MTT assay. The expression level of MEKK2 was measured using RT-PCR, Western blot and luciferase reporter gene assay. The activity of activator protein 1 (AP-1) was detected using luciferase reporter gene assay. The phosphorylation levels of JNK and c-Jun were measured using Western blot. The expression levels of HBx and MEKK2 in 11 clinical hepatocellular carcinoma (HCC) tissues were measured using real time PCR and Western blot. In addition, the expression of MEKK2 in 95 clinical HCC tissues was examined using immunohistochemistry.

Results:

HBx significantly enhanced HepG2-X cell proliferation. In HepG2-X, H7402-X and HepG2.2.15 cells, the expression level of MEKK2 was remarkably increased. In HepG2.2.15 cells, HBx was found to activate JNK and AP-1, which were the downstream effectors of MEKK2 in HepG2-X and HepG2.2.15 cells. In 11 clinical HCC tissues, both HBx and MEKK2 expression levels were remarkably increased, as compared to those in the corresponding peritumor tissues. In 95 clinical HCC tissues, the rate of detection of MEKK2 was 85.3%.

Conclusion:

HBx promotes hepatoma cell proliferation via upregulating MEKK2, which may be involved in hepatocarcinogenesis.     

沉默Rock2对肝癌细胞增殖及凋亡作用的研究

目的:探讨沉默Rock2基因对人肝癌细胞Huh-7和HepG2增殖和凋亡作用的影响.方法:实验分为空白对照组、干扰无意义组、转染PBS组及干扰Rock2组.将Rock2干扰质粒shRock2转染到人肝癌细胞Huh-7和HepG2中,通过实时荧光定量PCR检测Rock2 mRNA的表达水平;Western blot检测Rock2蛋白的表达水平;MTT比色法检测沉默Rock2后对Huh-7和HepG2细胞增殖抑制的影响;流式细胞术检测沉默Rock2对Huh-7和HepG2细胞周期及早期凋亡的变化.结果:将shRock2转染肝癌细胞系Huh-7和HepG2后,Rock2 mRNA以及Rock2蛋白的表达水平均明显下降.沉默Rock2表达后,MTT结果显示Huh-7和HepG2细胞较对照组细胞增殖能力明显减弱(P＜0.01);Huh-7和HepG2细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肝癌细胞的早期凋亡较对照组明显增加(P＜0.01).结论:沉默Rock2能明显抑制肝癌细胞系Huh-7和HepG2的增殖,并诱导其早期凋亡,提示Rock2可作为肝癌基因治疗的一个新的分子靶点.     

Involvement of the p38 MAPK signaling pathway in S‐phase cell‐cycle arrest induced by Furazolidone in human hepatoma G2 cells

Given the previously described essential role for the p38 mitogen‐activation protein kinase (p38 MAPK) signaling pathway in human hepatoma G2 cells (HepG2), we undertook the present study to investigate the role of the p38 MAPK signaling pathway in cell‐cycle arrest induced by Furazolidone (FZD). The aim of this study was to determine the effects of FZD on HepG2 cells by activating and inhibiting the p38 MAPK signaling pathway. The cell cycle and proliferation of HepG2 cells treated with FZD were detected by flow cytometry and MTT assay in the presence or absence of p38 MAPK inhibitors (SB203580), respectively. Cyclin D1, cyclin D3 and CDK6 were detected by quantitative real‐time PCR and western blot analysis. Our data showed that p38 MAPK became phosphorylated after stimulation with FZD. Activation of p38 MAPK could arise S‐phase cell‐cycle arrest and suppress cell proliferation. Simultaneously, inhibition of the p38 MAPK signaling pathway significantly prevented S‐phase cell‐cycle arrest, increased the percentage of cell viability and decreased the expression of cyclin D1, cyclin D3 and CDK6. These results demonstrated that FZD arose S‐phase cell‐cycle arrest via activating the p38 MAPK signaling pathway in HepG2 cells. Cyclin D1, cyclin D3 and CDK6 are target genes functioning at the downstream of p38 MAPK in HepG2 cells induced by FZD. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.