昆明市妇幼保健院2014～2018年门急诊手足口病的病原构成变化

  目的  通过对昆明市妇幼保健院手足口病病原构成观察，了解肠道病毒EV71疫苗接种后免疫保护情况；为肠道病毒EV71疫苗接种推广提供临床客观依据。  方法  采集2014年1月至2018年12月间到昆明市妇幼保健院门急诊就诊临床确诊手足口病患儿的粪便标本，进行肠道病毒EV71，柯萨奇病毒A组16型，肠道病毒通用型PCR检测。按照是否接种肠道病毒EV71型灭活疫苗分为观察组和对照组。比较2组EV71及非EV71型病原构成比；同时把是否EV71感染作为因变量，是否接种疫苗，性别和年龄作为自变量进行多因素分析。  结果  观察组和对照组感染肠道病毒EV71构成比分别为0.6%、15%，2组之间存在差异（χ2 = 27.088，P < 0.05）。多因素分析结果显示只有是否接种疫苗为影响因素，接种疫苗为保护因素，接种疫苗者对EV71保护率达96.8%。  结论  昆明市妇幼保健院门急诊手足口病患儿中接种肠道病毒EV71灭活疫苗者感染肠道病毒EV71的构成比低于未接种者，推广疫苗接种对人群预防EV71感染引起的手足口病有很好的效果。     

癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合的变化

目的 探讨癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合的变化。方法 将50只Wistar大鼠随机分为正常对照组和癫痫组,癫痫组分为癫痫持续状态后4、8、24和72h组,观察癫痫持续状态后不同时间点大鼠海马线粒体分裂、融合的变化。Western blotting、PCR分析海马线粒体中Drp1、hFis1、 Mfn1、Opa1的表达;免疫组化分析海马CA3区神经细胞Drp1、Opa1的表达。结果 Drp1、 hFis1在癫痫持续状态后4h时开始升高,24h达高峰,72h仍处于较高水平;Mfn1、Opa1在癫痫持续状态后4h时出现短暂的升高,随即表达下降,并于24h时达最低水平。癫痫持续状态后24h时,大鼠海马CA3区Drp1阳性神经元数目显著高于对照组(P＜0.05),Opa1阳性神经元数目显著低于对照组(P＜0.05)。结论 癫痫持续状态大鼠海马线粒体分裂、融合失衡,主要表现为线粒体分裂增强、线粒体融合抑制。     

木犀草素对肠道病毒71型感染细胞的影响

目的: 探讨木犀草素体外抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染的机制。方法: 分别用0、25、50、100、200、400 μg /mL木犀草素处理人横纹肌肉瘤（RD）细胞,48 h后检测细胞存活率;另将RD细胞分为对照组(常规培养)、木犀草素组(25、50、100 μg/mL)、EV71感染组和木犀草素(25、50、100 μg/mL)+EV71感染组,于病毒感染48 h后,MTT法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测Caspase-3表达,ELISA法检测细胞TNF-α,IL-β,IL-6和IL-10浓度。结果： 与0 μg/mL相比,25、50、100 μg/mL木犀草素对RD细胞存活率无明显影响(P>0.05);25、50和100 μg/mL木犀草素+EV71感染组RD细胞存活率均明显高于EV71感染组(P均<0.05);与EV71感染组相比,木犀草素+EV71感染组细胞凋亡率和Caspase-3表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10分泌明显减少(P均<0.05)。结论： 木犀草素可能通过抑制细胞凋亡和减少促炎症因子分泌,抑制EV71对细胞的感染。     

基于Drp1-Ser637磷酸化探讨补阴牵正方对PD小鼠脑线粒体的影响

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只。除正常组外,其余3组小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型,补阴牵正方组灌胃补阴牵正方水煎剂,每天灌胃2次,连续28 d,美多芭组腹腔注射美多芭,隔天1次,共28 d。爬杆法、抓握法观察小鼠行为学;免疫荧光组化法观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目;荧光素酶法测定脑线粒体三磷酸腺苷(ATP);JC-1法检测脑线粒体膜电位;蛋白印迹法(Western blot)检测脑蛋白Drp1及其磷酸化蛋白Drp1-Ser637表达。结果相比正常组,模型组小鼠爬杆时间延长(P0.01),抓握力度减弱(P0.01),黑质TH阳性神经元数目减少(P0.01),脑线粒体膜电位及ATP水平降低(P0.01),脑Drp1蛋白表达增加(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达降低(P0.01)。与模型组相比,补阴牵正方组小鼠在第14天爬杆时间缩短、握力明显增加(P0.05),黑质TH数目明显增加(P0.05),Drp1蛋白表达减少(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达增加(P0.05),脑线粒体膜电位及ATP水平显著升高(P0.01);而美多芭组除在第14天行为学较模型组有明显改善外(P0.05),其余指标均无统计学差异;补阴牵正方组与美多芭组比较其黑质TH数目、ATP水平及膜电位均有差异(P0.05,P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达也显著增加(P0.01)。结论补阴牵正方可能通过下调维持线粒体动态平衡的分裂蛋白Drp1、上调Drp1-Ser637磷酸化位点的表达改善PD小鼠脑线粒体功能,从而保护中脑黑质多巴胺神经元达到防治PD的作用。     

槲皮黄酮改善心肌细胞肥大过程中对线粒体功能及动力学的影响

[目的]探讨槲皮黄酮对原代心肌细胞肥大、线粒体功能及动力学的影响。[方法]原代培养大鼠心肌细胞,采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及槲皮黄酮共同干预细胞48、72 h后,BCA试剂盒检测细胞中蛋白浓度,倒置显微镜分析心肌细胞直径;酶标仪检测心肌细胞内三磷酸腺苷（ATP）及活性氧（ROS）含量,JC-1方法分析心肌细胞线粒体膜电位（MMP）;蛋白免疫印迹（Western Blot）方法测定线粒体动力学相关蛋白视神经萎缩蛋白（OPA1）、动力相关蛋白（Drp1）及磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）表达量。[结果]与空白组比较,模型组心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著升高（P<0.05）,ATP和MMP值则显著降低（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,槲皮黄酮处理72 h后心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著降低（P<0.05）,ATP和MMP值则显著升高（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著增高（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。[结论]槲皮黄酮对AngⅡ引起的心肌细胞肥大具有保护作用,其作用机制可能与降低心肌细胞线粒体功能障碍、稳定线粒体动力学平衡相关。     

长期低剂量锰染毒对子代大鼠睾丸生精细胞线粒体状态和细胞凋亡的影响

目的 探讨长期低剂量氯化锰染毒对子代大鼠睾丸生精细胞线粒体形态和凋亡的影响.方法 健康雌性SD大鼠32只分为对照组、低、中、高剂量组.腹腔注射2、4和8 mg/kg MnCl2·4H2O或生理盐水,1次/天,5天/周,共8周,并在妊娠期和哺乳期继续染毒.每组8只12周龄子代大鼠断头处死后,观察睾丸生精小管结构和生精细胞线粒体形态、视神经萎缩蛋白1(Opa1)、动力相关蛋白1(Drp1)、半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)表达和细胞凋亡情况.结果 随锰染毒剂量增加,生精细胞层数逐渐减少,细胞排列紊乱、数量减少;中、高剂量组可见线粒体分离、肿胀等表现;中、高剂量组Opa1显著降低(P＜0.05,P＜0.01),Drp1、Caspase9则随锰染毒剂量增加而递增(P＜0.05,P＜0.01);锰染毒组生精细胞凋亡指数随锰染毒剂量增加而上升(P＜0.05).结论 长期低剂量锰染毒可调节Opa1/Drp1基因表达而影响线粒体功能,导致子代大鼠生精细胞凋亡.     

Tiger17促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖和迁移

  目的  观察在不同浓度 Tiger17作用于人口腔黏膜成纤维细胞（hOMF）不同时间后对细胞增殖和迁移的影响。  方法  培养hOMF细胞，CCK8和划痕实验检测不同浓度Tiger17作用于hOMF细胞不同时间后细胞增殖和迁移的变化；Western Blot 检测hOMF细胞表达TGF-β1、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的水平。  结果  100 μg/mL和200 μg/mL Tiger17对hOMF的增殖活性在48 h明显高于对照组（P < 0.05）；100 μg/mL Tiger17对hOMF的迁移率在24 h和48 h均明显高于对照组（P < 0.01）；不同浓度的Tiger17作用于hOMF 24 h和48 h后，细胞表达TGF-β1、p-Erk1/2蛋白升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  Tiger17使hOMF细胞表达TGF-β1、p-Erk1/2升高，促进hOMF细胞的增殖和迁移。     

肠道病毒71型对Vero细胞线粒体的损伤作用及机制

目的探讨肠道病毒71型（EV71）对Vero细胞的损伤作用及机制,为分析EV71的致病机制提供新思路。方法将临床分
离的一株EV71接种于Vero细胞,观察细胞的形态改变,用免疫荧光方法检测EV71抗原在Vero细胞中的表达,用透射电镜观察
Vero细胞超微结构的改变,用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测试分析病毒颗粒直径和面积密度以及空泡化线粒体的比例和
面积密度。结果EV71感染后Vero细胞形态发生改变,由梭形变为圆形或死亡,免疫荧光检测显示EV71抗原定位于胞质,超
微结构观察可见胞质中有大量呈团块状分布、晶格状排列的高电子密度病毒颗粒,颗粒平均直径为16.3 nm,平均面积密度为
38.3%;线粒体肿胀、变性并空泡化、崩解,空泡化线粒体数量约占90.9%,平均面积密度为89.2%;部分线粒体内可见EV71病毒
颗粒。结论EV71感染Vero细胞后在其胞质中增殖,并可侵入线粒体,导致线粒体直接损伤并致细胞死亡;线粒体是EV71在
Vero细胞内的作用靶标。
     

RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响

 目的 研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶 (adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响。方法  运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响。由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组。结果   ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑。病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加。EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组。结论ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组。     

肠道病毒71型温度适应性进化对毒株毒力的影响研究

目的 研究EV71病毒温度适应性进化过程中的毒力变异,为相关手足口病的防控提供参考。方法 以EV71姊妹株（谱系#100、#101）亲代株、各温度适应株分别感染Vero细胞,进行噬斑实验验证、CCK-8细胞毒性实验、Vero细胞感染后宿主蛋白质组学研究,确认表型差异、比较不同毒株细胞抑制率,质谱检测并分析宿主细胞差异表达蛋白的功能。结果 确认Vero细胞感染热适应株（谱系#101）后发生噬斑变异;各温度适应株细胞抑制率较亲代株均有增长,但增幅不同。聚类分析与主成分分析显示,Vero细胞感染后宿主蛋白质组表达热适应株与亲代株、冷适应株与常温适应株分别具有相似性,组间差异表达蛋白500种（上调蛋白239种,下调蛋白261种）;其中上调蛋白功能与转录后蛋白修饰等功能有关,下调蛋白则与SRP依赖性共翻译蛋白的膜定位/易位、逆蛋白转运有关。结论 EV71病毒在温度适应性进化中可能伴随毒力变异,其作用机制有待进一步研究。     

腺病毒55型对人肠道细胞感染性的实验研究

目的 明确腺病毒55型(HAdV-55)对人肠道细胞的感染性.方法 体外培养人结直肠腺癌细胞Caco-2,以HAdV-3、7、14和55感染,免疫荧光法检测感染细胞内病毒蛋白的表达,荧光定量PCR方法检测不同时间点细胞内和上清中病毒DNA水平,采用腺病毒敏感细胞株HEp-2感染实验检测Caco-2细胞上清中感染性病毒颗...     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在胶质瘤中的表达特性及其对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响。方法 采用实时荧光定量法(qRT-PCR)检测人星形胶质细胞NHA和胶质瘤细胞株U87、U251、SNB19、T98和LN229中TNFAIP3的表达,以U87和SNB19为实验对象。使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导小干扰RNA(siRNA)转染U87和SNB19以下调TNFAIP3的表达;采用Transwell检测下调TNFAIP3对U87及SNB19侵袭的影响;运用划痕实验检测下调TNFAIP3对U87及SNB19迁移的影响。结果 和NHA(0.144±0.008)相比,TNFAIP3在U87(1.380±0.066)、U251(0.663±0.062)、SNB19(1.405±0.032)、T98(1.002±0.068)、LN229(0.667±0.027)中的表达均升高(均P<0.05)。si-TNFAIP3转染U87及SNB19可下调TNFAIP3的表达,继续培养24 h, U87及SNB19侵袭和迁移能力均下降(均P<0.05)。结论 ...     

纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡的研究

  目的  探讨磷脂酰肌醇激酶-3/蛋白激酶B（phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKt）信号通路对纳米二氧化硅（nano silica,NS）粉尘诱导肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AM）凋亡发生的影响。  方法  通过不同质量浓度的NS粉尘染毒AM细胞后,CCK-8法检测细胞存活率;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞的凋亡率与线粒体膜电位;Western blot法检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及磷酸化（p）-PI3K、p-AKt的表达水平。  结果  NS可降低AM细胞的存活率,部分细胞出现凋亡形态学改变;LY294002预处理AM后,线粒体膜电位水平的下降程度增加,并下调Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白的表达,同时上调Bax蛋白的表达,增加细胞凋亡率。  结论  PI3K/AKt信号通路可能参与了NS诱导AM细胞的凋亡过程。     

2012–2020年成都市手足口病流行病学特征及EV71疫苗接种效果分析

  目的  分析2012–2020年成都市的手足口病流行病学特征,比较成都市在疫苗接种前后的发病差异,为手足口病的预防提供依据。  方法  采用描述性流行病学分析方法,对成都市2012–2020年报告的手足口病病例的发病率、病死率、重症率等进行分析。  结果  2012–2020年成都市手足口病累计发病279216例,重症2201例,死亡16例。2012–2019年发病率隔年上升,2018年达最大发病率（326.43/105）;重症率和病死率自2016年以来,呈现下降趋势。共有实验室检测病例11892例,EV71、Cox A16和其他肠道病毒分别占总数的14.8%、18.8%、66.3%。自2016年EV71型病毒感染发病总体呈下降趋势,Cox A16病毒型感染隔年上升,其他肠道病毒型感染总体呈上升趋势。病例主要集中在0～<5岁儿童组（92.1%）,尤以1～<2岁组发病最多,各年份均表现为男性发病高于女性。地区分布表明手足口病的高发地区在中心城市,平局发病率增速最大的三个区分别为:青白江区、双流区、龙泉驿区。时间分布表明手足口病发病呈明显的双峰分布,大部分集中在每年5–8月和10–12月,2018年7月发病达历年最高（12309例）。  结论  成都市未来在继续推进EV71疫苗接种的同时,更需要关注除EV71和Cox A16外的血清型病毒感染,开展针对多种肠道病毒的多价疫苗的相关研究。防控重点可放在人口密度大、流动人口多、涉农街道多以及人员卫生意识不够强的地区。针对第二圈层的城区,可以加强对涉农街道的消毒,同时对卫生意识不强的人员和托幼机构进行卫生宣讲等活动。另外手足口病防控也可在高发季节给予更多关注。