登革1型和2型病毒混合感染样本的一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本文旨在建立检测登革1型和2型病毒的一步法实时荧光定量PCR方法,为登革热的诊断和预测提供技术支撑。依据登革1型和2型病毒的保守区序列设计引物和探针,建立了同时检测两个血清型登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法。特异性实验结果显示,该方法可检测出登1型和2型病毒,与登革3型、4型病毒、黄热病毒、流感H3N2病毒均无交叉反应,具有较好的特异性。对登革1型和登革2型的灵敏度均为102copies/μL。应用该方法,可检测出登革1型和2型病毒混合感染C6/36后不同时间点病毒复制动态。在两个血清型登革病毒混合感染C6/36细胞72~120 h登革2型病毒的拷贝数与单独感染时登革2型病毒的拷贝数相比显著下降。上述研究证实建立的一步法实时荧光定量PCR方法具有特异性好灵敏度高、重复性好等特点,能够用于登革型和2型病毒混合感染样本的检测。     

登革热疫点22年后的血清流行病学调查

目的了解曾发生登革热流行的旧疫区健康人群抗登革病毒的抗体水平及分布。方法在1986年曾爆发Ⅱ型登革热疫情的黄埔区鱼珠街一带,对2周内无临床症状的健康人群横断面采样,收集血清,ELISA法检测血清中抗登革病毒IgG抗体,并和非疫点健康人群抗登革病毒IgG抗体阳性率进行比较。RT—PCR法检测抗体阳性者血清中登革病毒。结果登革热疫点健康人群抗登革病毒IgG抗体阳性率为23.3％,非疫点健康人群抗登革病毒IgG抗体阳性率为3．8％,两者差异有统计学意义（P〈0．01）;登革热疫点人群抗体阳性率与年龄成正相关,0～20、21～30、31—40、41～50、51—60、61～70和70岁以上各年龄组的抗体阳性率分别为3．8％、5．8％、9．1％、26．5％、27．7％、32．5％和35．1％。30岁以下年龄组与31～40岁年龄组、31～d0岁年龄组与41～60岁年龄组、41-60岁年龄组与61岁年龄组间的抗登革病毒IgG抗体阳性率差异分别具有统计学意义（P〈0．05）。登革热疫点和非疫点15岁以下中小学生滤纸血样标本中均未检测到抗登革病毒IgG抗体。RT—PCR法未检测到抗体阳性者血清中有登革病毒。结论登革热疫点人群抗登革病毒IgG阳性率明显高于非疫点人群,疫点人群抗体阳性率随年龄增长而上升,提示登革热疫点在登革热疫情后,登革病毒可能在蚊媒体内存在低密度的循环。     

广州市2002-2006年登革热病例特征

目的分析2002-2006年广州市1342例登革热（dengue fever，DF）患者病例特征，以期更好地做好DF的防治工作。方法对我院2002-2006年收治的1342例DF患者的资料进行回顾性分析，用C6／36细胞分离血液登革病毒（dengue virus，DV），逆转录聚合酶链反应与基因测序法鉴定病毒。结果1342例患者平均年龄为34．4岁，分布无明显性别差异。大多数患者有明显的病毒血症，主要临床表现为发热（100％）、头痛（85．9％）、肌肉酸痛（64．5％）、骨痛（46．6％）和皮疹（65．9％）等。实验室检查外周血白细胞及血小板减少者分别占66．0％和61．3％，丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）升高分别占69．0％和85．7％，部分患者（28．4％）出现血钾降低，除2例诊断为登革出血热外，均诊断为典型登革热。病原学检查血清登革病毒抗体IgM（DF-IgM）阳性率为90％，其中病程5天内累积阳性率为31．3％，8天内为86．4％，经病毒分离与鉴定证实均为DV—Ⅰ型感染。结论广州市2002-2006年流行的DF均为DV—Ⅰ型所致，绝大多数病例符合DF的典型临床表现，肝损害为常见的并发症，登革出血热极少见。     

深圳市首例本地登革热3型病例的病原学检测与分析

目的对2016年深圳市报告的首例本地疑似登革热病例查明病因.分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征.方法对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒抗体、NS1抗原和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析.结果从患者血清标本中检测到登革病毒IgM抗体、NS1抗原和登革3型病毒核酸,并成功分离到登革3型病毒,将其命名为DENV3-SZ1648.深圳市登革3型病毒分离株SZ1648与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为92.0％、91.8％和90.3％,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为68.7％、64.2％和63.2％.进化树显示SZ1648株与2007年印度尼西亚分离株MKS-0098亲缘关系最近,在进化树的同一分支上,和85-159株(Indonedia 1985)、2167株(Tahiti 1989)、29472株(Fiji1992)等同属基因Ⅰ亚型.患者发病前1个月在深圳居住,无输血史、无外出史.结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该本地病例是由登革3型病毒引起,这也是深圳市首次报道存在本地登革3型病毒的疫情,该毒株最有可能来源于印度尼西亚.     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

广州市一起登革热家族聚集性暴发事件的调查与分析

目的探讨登革热家庭聚集性发病的流行病学特点及传播效率，为今后进行有效的预防和控制登革热暴发提供参考。方法采用现场流行病学调查方法对广州市一起登革热家庭聚集性暴发事件进行调查和分析；采用ELISA、RT-PCR和病毒分离的方法对标本进行检测。结果2006年8月广州市荔湾区发生一起登革热家庭聚集性暴发事件，该家族15名家庭成员先后共有6人发病，罹患率40．0％，其中6例患者登革热抗体IgM或IgG阳性3例，病毒分离阳性3例，荧光PCR检测阳性者1例，基因序列测序和病毒分离结果最终确定为登革I型病毒。结论根据临床表现、实验室检测结果以及流行病学调查．虽然该家族部分患者登革热抗体为阴性，但病例发病均在一个最长潜伏期内，因此可以确定该家族发生了登革热聚集性暴发，荔湾区龙津中路龙兴里最有可能是共同感染地．感染来源不明，感染时间为家庭聚会日可能性大。     

2009年广州市2例输入性登革热病例的调查

目的了解2009年广州市2例输入性登革热病例的流行病学、病原学检查特点。方法对患者及密切接触者流行病学及临床资料进行回顾性分析,采用免疫层析法、ELISA法对患者血清样本进行登革热IgM、IgG抗体检测,并采用PCR对病毒进行分型。结果两名患者均来自登革热疫区,出现乏力、发热、头痛等症状。患者的DEV-IgM均呈阳性,DEV-IgG呈阴性,病毒型别均为登革Ⅰ型。结论两名患者为实验室确诊病例,由于发现及时,患者救治方案正确,各项防控措施落实到位,2例患者均痊愈出院,未发生二代病例,疫情得到有效控制。     

一起成人群体发热患者的病毒分离与鉴定

目的 从一起成人群体发热患者咽拭子标本中分离、鉴定病毒并研究其与疾病的关系.方法 采集患者咽拭子标本,接种细胞分离病毒,以中和试验和分子生物学技术鉴定分离病毒;用分离的病毒制备抗原片,采用间接免疫荧光法检测患者血清中特异性IgM、IgG抗体.结果 从10份发热患者咽拭子标本中分离到2株病毒,经核苷酸序列分析和中和试验证实为腺病毒11型;10例发热患者血清中,6例抗腺病毒11型特异性IgM阳性,3例特异性IgG阳性,1例特异性IgM、IgG均阴性.结论 从患者咽拭子标本中分离到的腺病毒B组11型可能为引起此次群体发热的病原体.     

广州地区白纹伊蚊体内登革病毒的检测

目的了解广州地区登革热传播媒介白纹伊蚊携带登革病毒的情况，为登革热预防控制提供预测预警信息。方法从广州11个行政区及其登革热旧疫点捕获白纹伊蚊成蚊和幼虫（经实验室培育羽化成成蚊），提取登革病毒RNA，One step SYBR Green I实时RT-PCR进行检测。结果2005—2007年从广州地区采集的493批白纹伊蚊（6255只）中，共检测出两份阳性结果，分别来自登革热疫点和旧疫点，经测序证实为登革I型．其余为阴性。最低感染率为0．32。结论本文白纹伊蚊携带登革病毒比率较低，可能与登革病毒在蚊体内传代的递减效应、采样时间滞后以及广州登革热非连续性爆发有关。     

登革病毒特异性抗原片段的筛选鉴定及其ELISA方法的建立

目的 筛选、鉴定登革病毒共同及型特异性抗原,用纯化抗原建立检测登革病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E、NS1蛋白进行分析,预测可能的抗原表位.并根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析登革病毒的共有及型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a、pMAl-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应特异性.Western blot检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒抗原表位18个,登革病毒型特异性抗原表位25个,并对其中得分值较高的5段进行了高效表达,经Western blot分析,获得登革1～4型(Den-Ag5),登革2、4型(Den-Ag3),登革1～3型(Den-Ag2)病毒共同抗原片段各一段,登革1、2、4型( Den-Ag1、Den-Ag4)共同抗原片段两段,与流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒及所用甲病毒多克隆抗体均无交叉反应.选择Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2作为检测用抗原,建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法,初步应用表明,所建立方法具备良好特异性,可检测50～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在15以上.结论 经系统筛选,获登革病毒特异性抗原片段5段,并建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法.     

Laboratory diagnosis of primary and secondary dengue infection.

BACKGROUND: Dengue fever is routinely detected in many laboratories using commercial tests for the specific detection of dengue IgM antibodies. OBJECTIVES: We have studied the sensitivity of IgM antibody detection in paired serum samples of 43 patients with either with primary dengue (PD) or secondary dengue (SD). STUDY DESIGN: Two consecutive samples were drawn from 23 Vietnamese and 20 German patients. All patients were selected for a positive PCR and for the fact that consecutive serum samples were available. The diagnosis of PD was based on seroconversion to dengue antigen and in SD on the detection of virus RNA in the presence of anti-dengue IgG antibodies. RESULTS: In samples of patients with PD fever taken during days 1-3 of the disease no IgM antibody could be detected. During days 4-7 and after day 7, IgM antibody was detected in 55% and 94%, respectively. In patients with SD fever, even less positive IgM samples were found in samples taken during days 4-7 (47%) and after day 7 (78%). IgG titers were significantly higher in SD compared to PD patients, although high (>1280) titers were also found in some PD patients. CONCLUSION: In numerous acute dengue fever patients an early diagnosis will be obtained only by combining IgM antibody detection with detection of virus or virus RNA using RT-PCR.     

2009年广州市首起本地感染登革热家庭聚集性暴发疫情的调查与处理

目的 探讨登革热家庭聚集性发病的流行病学特点及采取的防控措施,为今后进行有效的预防和控制登革热暴发疫情提供参考。方法 采用现场流行病学调查方法对广州市首起登革热家庭聚集性暴发疫情进行调查和分析;采用ELISA和RT-PCR的方法对标本进行血清学检测和病毒分型。结果 2009年8月广州市越秀区发生的一起登革热家庭聚集性暴发事件中,该家庭4名成员中有3人同时发病,这3例患者登革热抗体IgM均阳性,其中RT-PCR检测阳性者2例,病毒分型均为登革Ⅲ型。并且,在实验室回顾性检测中发现,家庭聚集性疫情出现前有1例输入性登革病例,病毒分型也为登革Ⅲ型,且病毒基因测序结果提示两者之间存在明显关联。结论 根据流行病学调查结果、临床表现和实验室检测结果,可以确定该家庭发生了本地感染的登革热聚集性暴发。感染地是三元里大道景苑街居住地;感染来源可能是输入性疫情引起的,输入性疫情与本地疫情之间的这种流行病学关联在广州市还是首次获得。因此,广州市登革热疫情是由输入性疫情引发的本地疫情的趋势未改变,做好输入性疫情防控是防止疫情扩散的有力措施。     

2006-2007年广东省登革病毒Ⅰ型分离株E基因序列的分子进化

目的 揭示广东省2006-2007年各地登革病毒流行株的遗传关系,探讨其可能来源.方法 收集广东省2006年5个流行区、2007年4个流行区登革毒株和近几年广东省分离的登革病毒流行毒株,设计覆盖登革Ⅰ型病毒E(包膜蛋白)基冈的3对扩增片段瓦相嵌套的引物,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行扩增,扩增产物纯化后直接进行序列测定,所得序列经拼接成E基因全长序列后,同时与GenBank上扶得的登革Ⅰ型病毒E基因序列一起,用MEGA 4.1软件进行分析.结果 2006年广州流行株来源于越南;阳江、南海流行株来源于阳江本地;汕头、潮州流行株来源于新加坡.2007年流行株都来源于新加坡.结论 广东省2006年发生的登革热疫情来源多样,而2007年疫情来自同一源头,近几年广东省流行的登革病毒主要来源于东南亚等国,但在广东省局部地区已形成地方性流行.     

Study of viremic profile in febrile specimens of chikungunya in Bandung,Indonesia

BackgroundData regarding the viremia profile of chikungunya virus (CHIKV) infected patients especially during the pre-febrile period is limited.ObjectiveTo obtain virological kinetic data on CHIKV infections.Study designA two-week community observation for dengue transmission was conducted in Bandung, Indonesia, from 2005 to 2009. Acute specimens from non-dengue febrile patients were screened by pan-alphavirus conventional RT-PCR. The positives were confirmed for CHIKV RNA by a specific RT-PCR followed by sequencing. Simultaneously these specimens were also cultured in Vero cells and tested for anti-CHIK IgM MAC-ELISA. All the available serial specimens,including the pre-febrile specimens, from confirmed CHIK cases, were tested by virus isolation, RT-PCR, qRT-PCR, and CHIK IgM ELISA.ResultsThere were five laboratory confirmed CHIK cases identified and studied. Among these, viremia was determined to extend from as early as 6 days prior to until 13 days post fever onset. Quantitative RT-PCR showed viremia peaked at or near onset of illness.ConclusionIn this study, individuals were identified with viremia prior to fever onset and extending beyond the febrile phase. This extended viremic phase has the potential to impact transmission dynamics and thus the public health response to CHIK outbreaks.     

中国人4型登革病毒E基因部分片段的cDNA克隆与序列分析

１９９３年１０月广东省发生登革热的流行，我们从其中一个病人血清中扩增到４型登革病毒（ＤＶ４）包膜蛋白基因（Ｅ）的部分ｃＤＮＡ片段，对其进行了分子克隆及序列测定。ＤＶＲＮＡ经随机引物逆转录后用ＤＶ４特异的引物扩增，获得４２１ｂｐ的产物，补齐和提纯后插入ｐＵＣ１８和ｐＵＣ１９质粒载体，采用双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列，与同型ＤＶ代表株比较，同源性达到９３７２％，与不同型ＤＶ的同源性介乎６１２６％～６４４０％，而与同属的乙型脑炎病毒比较，同源性只有４０３１％。比较推导的氨基酸序列后发现一个含有１２个氨基酸的保守区，可能是黄病毒属中具有重要生物学功能的部位。     

Serological markers during dengue 3 primary and secondary infections.

BACKGROUND: The detection of the IgM antibody for the dengue virus in serum by ELISA has become one of the most important and useful methods for diagnosis of dengue using a single acute-phase serum sample. Currently, this system is an invaluable tool for the surveillance of dengue fever (DF) and dengue hemorrhagic fever (DHF). The usefulness of other serological markers such as IgA and IgE have been less studied. OBJECTIVE: To study the IgM, IgA and IgE specific antibody response in dengue 3 infected patients with different clinical picture and type of infection. STUDY DESIGN: One hundred and twenty-seven serum samples collected on days 5-7 at the onset of fever from clinically and serologically confirmed dengue cases were studied. Forty-two were classified as primary dengue fever cases, 48 as secondary dengue fever cases and 37 as secondary dengue hemorrhagic fever cases. All samples were tested by capture ELISA in order to detect dengue IgM, IgA and IgE antibodies. RESULTS AND CONCLUSIONS: In this study, significant differences were observed in the IgM, IgA and IgE response between the study groups. High IgA and IgE OD ratios in secondary dengue cases were found. The usefulness of serotype specific IgM antibody detection is also analyzed and discussed. A priority for future dengue research in terms of protection, recovery of infection and immunopathogenesis is to elucidate the role of these immunoglobulins. The cross reactivity response to IgM between dengue virus serotypes in primary and secondary cases should also be more studied.     

Epidemiology and characteristics of the dengue outbreak in Guangdong,Southern China,in 2014

Dengue is a rapidly spreading mosquito-borne disease caused by the dengue virus (DENV) and has emerged as a severe public health problem around the world. Guangdong, one of the southern Chinese provinces, experienced a serious outbreak of dengue in 2014, which was believed to be the worst dengue epidemic in China over the last 20 years. To better understand the epidemic, we collected the epidemiological data of the outbreak and analyzed 14,594 clinically suspected dengue patients from 25 hospitals in Guangdong. Dengue cases were then laboratory-confirmed by the detection of DENV non-structural protein 1 (NS1) antigen and/or DENV RNA. Afterwards, clinical manifestations of dengue patients were analyzed and 93 laboratory-positive serum specimens were chosen for the DENV serotyping and molecular analysis. Our data showed that the 2014 dengue outbreak in Guangdong had spread to 20 cities and more than 45 thousand people suffered from dengue fever. Of 14,594 participants, 11,387 were definitively diagnosed. Most manifested with a typical non-severe clinical course, and 1.96 % developed to severe dengue. The strains isolated successfully from the serum samples were identified as DENV-1. Genetic analyses revealed that the strains were classified into genotypes I and V of DENV-1, and the dengue epidemic of Guangdong in 2014 was caused by indigenous cases and imported cases from the neighboring Southeast Asian countries of Malaysia and Singapore. Overall, our study is informative and significant to the 2014 dengue outbreak in Guangdong and will provide crucial implications for dengue prevention and control in China and elsewhere.     

用逆转录-聚合酶链反应检测海南岛登革热流行区某些动物体内登革病毒RNA

目的寻找中国海南岛一带登革热疫区，登革病毒潜伏的动物宿主及鉴定其毒株型别。方法采用１－４型登革病毒通用引物，用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测海南岛登革热流行区蝙蝠脑细胞，血清和埃及伊蚊的登革病毒ＲＮＡ。结果检测３５例疫区蝙蝠脑细胞，２０例阳性；检测１８例蝙蝠血清，３例阳性；检测三组埃及伊蚊，１组阳性，３组非流行区者都阴性。用４个登革病毒原型株的单克隆荧光抗体技术检测２０例登革病毒ＲＮＡ阳性的蝙蝠脑细胞压印片，１６例为２型株阳性，与ＲＴ－ＰＣＲ检测登革热流行区登革病毒ＲＮＡ阳性蝙蝠脑细胞的阳性符合率为８０００％。用ＲＴ－ＰＣＲ检测非流行区蝙蝠脑细胞登革病毒ＲＮＡ，均为阴性。结论本研究证实蝙蝠是登革病毒的贮存宿主，为登革热流行的有效控制提供了一定重要的线索。