GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。 方法：采用逆转录PCR（RT-PCR）法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZ cDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine 2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。 结果：HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20 kD。 结论：成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的 设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法 采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长，在其5’端连上loxP位点，EcoR I、BamH I双酶切，同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长，并在3’端连上loxP位点，两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，DNA序列分析鉴定重组质粒。结果 SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论 本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化，黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。     

TRAF1-DsRed真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的定位

目的 构建融合蛋白TRAF1-DsRed的真核表达载体及观察TRAF1在COS-7细胞中的表达及定位.方法采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增TRAF1cDNA,定向克隆至真核表达载体pDsRed C1,经脂质体转染COS-7细胞并以间接免疫荧光检测其在COS-7中表达.运用罗丹明123染色和激光共聚焦技术观察TRAF-1在COS-7细胞中的定位.结果转染重组子pTRAF1-DsRed的COS-7细胞可见红色荧光蛋白的表达,TRAF1在COS-7细胞中定位于线粒体.结论 成功构建pTRAF1-DsRed融合基因并进行真核表达,确定TRAF-1在COS-7细胞中的定位,为进一步研究有关TRAF1的信号传导通路奠定了基础.     

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。     

人线粒体融合蛋白-2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2, MFN2)基因真核表达载体并对其进行鉴定。方法在pEGFP-N1载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列,酶切、测序验证是否插入及正确性。将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cel s,VSMCs),荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达;荧光定量PCR和Western blot分别检测MFN2的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了人MFN2基因真核表达载体,其转染VSMCs后,可以检测到MFN2 mRNA及蛋白水平高表达(<0.01)。结论成功构建了人MFN2基因真核表达载体,且能够在原代VSMC中过表达。     

组蛋白变异体macroH2A1真核表达载体构建及其细胞内定位的研究

目的构建带有血凝素（HA）标签的小鼠组蛋白变异体macroH2A1（mH2A1）的真核表达载体,并观察其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况。方法提取内毒素休克的BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应获得内毒素休克小鼠肝脏组织的cDNA,以cDNA为模板使用PCR方法扩增得到mH2A1编码序列,并将其酶切后连接至带有HA标记的载体pcDNA3-HA上;对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。随后将重组质粒瞬时转染293T细胞,利用荧光显微镜观察。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明pcDNA3-mH2A1-HA真核表达质粒构建正确;经转染实验发现,该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论 mH2A1真核表达载体pcDNA3-mH2A1-HA的成功构建及明确其在哺乳动物细胞中的具体核定位,为进一步研究mH2A1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。     

pHsa—m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的构建肝脏特异性的微RNA—miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定。方法经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA—miR-122的前体序列，引入酶切位点和Poly T转录终止序列，将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中。将构建载体进行酶切、测序鉴定，再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后．经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测，鉴定载体功能性表达。结果miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上，且可表达出具有生物活性的miR-122，将该真核表达载体命名为pHsa-m122。结论成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122，有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用。     

巨噬细胞特异性真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人清道夫受体A(SR-A)启动子,构建巨噬细胞特异性的真核表达载体。方法:从人外周血中提取基因组DNA,采用PCR技术分别扩增人SR-A的启动子及第一内含子和增强子序列,并插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pcDNA-GFP中,构建巨噬细胞特异性表达载体pSRA-GFP。将pSRA-GFP转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术比较GFP在不同细胞中的表达水平。结果:成功克隆SR-A启动子,其在巨噬细胞RAW264.7中的表达活性显著高于NRK、LLC、Hepa1-6等非巨噬细胞株(P<0.05)。结论:构建的表达载体pSRA-GFP具有良好的组织细胞特异性,可用于巨噬细胞特异性miRNA表达载体的构建。     

含TK自杀基因真核表达载体的构建和鉴定

基因治疗恶性肿瘤是当前国内外研究的热点之一，其中以药物敏感基因治疗系统最引人注目。药物敏感基因(drug sensitive gene)又称为“自杀基因”(suicide gene)，可以编码某些病毒或细菌的酶类，从而催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体转变为具有毒性的代谢产物，干扰细胞DNA的合成，选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞，而对正常组织无毒、副作用。     

人miR-16真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人miR-16真核表达载体,为研究其基因表达调控机制建立实验基础。方法从人类基因组DNA中扩增miR-16的前体序列,引入酶切位点和polyT转录终止序列,酶切后插入siRNA表达载体pSuper中,构建miR-16真核表达载体pmiR-16,然后进行酶切和测序鉴定;同时构建含miR-16完全互补序列及乙肝表面抗原HBsAg的报告质粒pXF3H-HBs。将pmiR-16与pXF3H-HBs共转染肝癌细胞系HepG2,通过HBsAg ELISA检测试剂盒检测表达产物HBsAg的改变,鉴定真核表达载体pmiR-16的生物学活性。结果成功构建了人miR-16真核表达载体pmiR-16及其报告质粒。pmiR-16与pXF3H-HBs共转染HepG2后,pmiR-16组HBsAg的基因表达与对照组相比显著降低,证实pmiR-16转染真核细胞后具有生物学活性。结论miR-16真核表达载体的成功构建为进一步研究其基因表达调控机制建立了实验基础。     

Septin8红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的septin8红色荧光蛋白融合表达载体（pmCherry—C2／septin8）,并观察其在细胞内的表达和定位情况。方法采用PCR的方法从人脑胶质细胞瘤eDNA文库中扩增获得septin8基因编码区序列,将其克隆至红色荧光蛋白载体pmCherry—C2上,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后转染NIH3T3细胞,并利用Westernblotting和细胞免疫化学技术分析重组蛋白在细胞内的表达和定位。结果重组pmCherry—C2／septin8融合蛋白在NIH3T3细胞中得到高量表达且主要分布于细胞浆。结论成功构建了pmCherry—C2／septin8融合表达载体,该载体能在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究septin8细胞内生物学功能打下了良好的基础。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM1的构建

ｃ－ｍｙｃ第一外显子在ｃ－ｍｙｃ转录调节中起着重要作用。为了解ｃ－ｍｙｃ第一外显子的生物学效应，探讨ｃ－ｍｙｃ的转录调控机制，为ｃ－ｍｙｃ表达增高性疾病的基因治疗提供依据，我们采用分子克隆技术，将１．３ｋｂ的人ｃ－ｍｙｃ第一外显子片段经克隆载体ｐＵＣ１９换得适宜克隆位点，回收目的片段再反向导入逆转录病毒表达载体ｐＬＮＣＸ，构建成人ｃ－ｍｙｃ第一外显子反义载体ｐＬＮＣ－ａＭ１。     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建HBsAg真核表达质粒。方法 用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3.1—S；然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定结果经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确。结论 真核表达质粒pcDNA3．1—S构建成功。     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建HBsAg真核表达质粒.方法用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-S;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确.结论真核表达质粒pcDNA3.1-S构建成功.