生物信息学分析亚洲牛带绦虫WD40基因及其蛋白质的结构与功能

目的 分析和预测亚洲牛带绦虫WD40基因及其编码蛋白的结构和特性，用于指导其生物学功能的实验研究。方法 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY，http：／／ca．expasy．org／）和IEDBAnalysisRecource提供的各种生物信息学在线分析程序，结合其它生物信息学分析软件包如Pcgene和VectorNTIsuite，从亚洲牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别WIMO基因及其编码区，分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。结果 该基因全长1208bp，编码区为81～1056bp，编码402个氨基酸，为全长基因；无跨膜区，具有多个磷酸化位点，蛋白的理化性质稳定，理论分子量为35942．4；没有质体、线粒体定位序列；预测该蛋白表面有三个亲水性强的线性表位和三个B细胞抗原表位。结论 应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫WD40基因，并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行了预测。     

亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因的克隆和分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫延伸因子-1（elongation factor 1,EF-1）基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：∥ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别延伸因子-1的全长编码基因并预测其蛋白的结构和功能。结果该基因是全长基因,长度988bp,编码区为67～868,编码269个氨基酸,无跨膜区;与GenBank中细粒棘球绦虫同源基因的一致性达87%,相似性达91%;预测三个主要的抗原表位位于135～140,126～131,157～162。结论应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出EF-1基因。     

猪带绦虫乳酸脱氢酶A和B的生物信息学比较分析

目的预测及比较分析猪带绦虫乳酸脱氢酶A（Taenia solium lactate dehydrogenase A,TsLDH-A）和乳酸脱氢酶B（Taenia solium lactate dehydrogenase B,TsLDH-B）,用于指导其生物学功能的研究。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http：//ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别LDH-A和LDH-B的全长编码基因并对其结构与功能进行生物信息学预测分析。结果两序列都是包含完整开放阅读框的全长基因,推导出的氨基酸序列与其它物种LDH-A或LDH-B同源基因的氨基酸序列的一致性均大于50%。两者编码的蛋白在编码的氨基酸数目（331）、蛋白的理化性质、L-乳酸脱氢酶结构域、构成LDH酶催化中心的关键氨基酸、包含LDH活性位点的线性表位、无亚细胞定位等方面是一致的,但两者在翻译后的修饰位点、3个跨膜区和其他线性表位方面既相似也有区别。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A和TsLDH-B的cDNA全长序列,并预测和比较了两者结构与功能方面的信息,为进一步研究所编码蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫ATP合酶B亚基全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别ATP合酶B亚基,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,用以指导实验研究。方法利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Vector NT Isuite软件包,识别华支睾吸虫ATP合酶B亚基基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果Blastx分析该基因为全长基因,属于ATP合酶B亚基家族,其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp,编码300个氨基酸,含有线粒体转运肽、两个跨膜区、一个核定位序列和多个磷酸化位点,具有较稳定的理化性质。结论ATP合酶B亚基是一个理想的真核种系进化的分子标志。华支睾吸虫ATP合酶B亚基具有线粒体和细胞核的双重定位序列,提示该蛋白可能在华支睾吸虫的能量代谢途径中发挥独特的调节作用。     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

新基因hKCNE4的克隆、表达及功能

KCNE4是KCNE家族中的一员,编码电压依赖性钾通道的B亚基。KCNE1、KCNE2、KCNE3均在人类基因组发现,并且有重要的生理功能,而KCNE4只是在鼠文库中得到,在人类cDNA文库中没有相关报道。本研究应用生物信息学分析,通过RT-PCR和RACE方法,从人类心脏cDNA文库中获取人类hKCNE4全长cDNA序列。其全长1188bp,编码170个氨基酸,和鼠KCNE4蛋白具有90％同源性。Northern Blot结果表明该基因在心脏、骨骼肌和肾脏高度表达。通过电子PCR方法将hKCNE4基因定位在2q35—36。亚细胞定位表明该基因的编码产物定位在细胞膜上,但体外电生理实验证明HERG基因同hKCNE4没有相互作用。     

大肠埃希菌O157：H7Tir基因的生物信息学分析

目的扩增和测序肠出血型大肠埃希菌O157：H7 tir打基因,利用生物信息学预测分析其结构和功能特征．以探讨Tir作为疫苗候选抗原的可能性。方法利用PCR技术扩增fir基因并测序,应用生物信息学网站在线分析工具和vectorNTISUite软件分析Tir蛋白结构和生物学功能,预测B细胞抗原表位。结果该基因全长1674bp,编码558个氨基酸,蛋白质总体亲水性高,有稳定的理化性质。含有3个结构和功能域,两段穿膜结构,多个磷酸化位点,预测20个B细胞线性表位。结论Tir毒力因子是很有前景的疫苗候选抗原,为肠出血型大肠埃希菌O157：H7的疫苗研究提供了理论依据。     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究

本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT04ag cDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨。采用5'RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA，借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析，以细胞生长曲线、FCM分析及RT-PCR技术分别观察重组。ALT04ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达。结果表明ALT04ag cDNA序列全长1115bp，含有编码194个氨基酸的开放阅读框架，计算预测其分子量为21KD，等电点为5．51。该序列登录Genbank(AF026816)时未发现同源序列(2001-1-30)。该基因转染的细胞有ALT04ag基因表达，ALT04ag基因表达可上调c-myc基因表达及加速细胞增殖速率，但对bcl-2及p53基因表达无影响，提示ALT04ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一。本研究为探索人肺癌诊断及治疗的分子靶标提供了新的线索。     

细粒棘球绦虫烯醇酶（EgEnolase）基因的克隆和序列分析

目的细粒棘球绦虫烯醇酶基因（EgEnolase）的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析。方法利用美国国家生物技术信息中心（NCBI,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPaSy,http：//ca.expasy.org/）,以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签（EST）数据库中发现烯醇酶的5’端和3’端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应（PCR）方法扩增其基因组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物,采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景。结果细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1449bp,含有两个长度分别为78bp和69bp的小内含子。该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区（aa104-124）,N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2＋结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心。该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199。该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210。结论细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达。     

应用生物信息学方法分析人HCA56基因

目的利用生物信息学对新克隆的人ligatin样基因HCA56的基因和蛋白序列进行分析,探讨生物信息学在新基因研究中的作用。方法以人类基因组数据库为基础,利用电子PCR和SAGE数据库对HCA56进行染色体定位和组织表达分布分析;BLAST程序进行HCA56的基因结构分析和相似序列搜索;ORF finder和Gene Runner3．05程序对HCA56编码蛋白进行序列预测和功能分析。结果得出HCA56的全长cDNA为2021bp,定位于染色体1q31-q32,其最长的开放读码框架为1755bp,编码584个氨基酸,编码氨基酸含有一个亮氨酸拉链和一假定的RNA结合保守序列。相似性搜索发现HCA56基因片段与人ligatin基因片段具有很高的相似性(99％)。SAGE结果显示HCA56在多种组织中都有表达。结论生物信息学是进行新基因研究的有效方法;HCA56很可能是ligatin的全长编码基因。     

日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长克隆及表达分析

目的 克隆日本沼虾血蓝蛋白基因,进行生物信息学及时空表达分析。方法 利用cDNA末端快速扩增技术（RACE ）从肝胰腺中克隆血蓝蛋白基因cDNA全长序列,用生物学软件对其序列进行生物信息学分析,时空表达分析采用实时荧光定量PCR方法。结果 日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长2 151 bp,包含14 bp的 5′UTR、148 bp的 3′UTR 和189 bp的开放阅读框（ORF）。ORF编码 663 个氨基酸,预测分子量为76.65kD,理论等电点为5.42,含有典型的3个血蓝蛋白结构域和2个保守的铜离子结合位点。与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70%和63%。 该基因在肝胰腺中的相对表达量最高,肌肉和血细胞表达较弱,大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达;肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低;嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加。结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾血蓝蛋白基因具有典型的结构域和保守的铜离子结合位点,在蜕皮间期的肝胰腺中呈高表达,是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

刚地弓形虫SAG3基因体外扩增及生物信息学分析

目的获取刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株表面抗原SAG3目的基因片段,对其结构和功能进行生物信息学分析,预测其编码蛋白作为候选抗原基因的可行性。方法提取弓形虫的基因组DNA,自行设计一对寡核苷酸引物,PCR体外扩增SAG3基因,用生物信息学方法对SAG3蛋白的理化性质、结构和功能进行预测。结果扩增出的基因片段约1174bp,测序后鉴定其为弓形虫RH株SAG3基因片段。预测SAG3蛋白相对分子质量约为41785．2。能形成两个功能结构域,氨基酸序列的前38（或39）位为信号肽序列。通过多种预测方法分析SAG3氨基酸序列抗原表位可能位于第10、50、80、95、160、180、220、250、300、330和360位点内或附近。结论成功获得SAG3基因,为深入研究该基因结构奠定了基础。     

Reverse vaccinology approach identify an Echinococcus granulosus tegumental membrane protein enolase as vaccine candidate

Applying reverse vaccinology strategy, we employed a sequence encoding an enolase from Taenia asiatica to search its homolog in the expression sequence tag (EST) database of Echinococcus granulosus and found two EST sequences (Access number: CN653186 and CN649593) of a clone Eg_PSGRS_13B09 from E. granulosus protoscolex full-length cDNA library, which are responding for the 5′ and 3′ partial cds of E. granulosus enolase, respectively. Primers are designed according to the 5′ end and 3′end of the putative encoding sequence to amplify the genomic DNA of E. granulosus strain isolated from sheep in Qinghai province of China by polymerase chain reaction (PCR). A sole product of 1,449 bp in length was obtained, which contains two little introns of 78 bp and 69 bp, respectively. The introns were excised by unsymmetrical PCR with combined flank sequences of introns as primers. The structural, functional, and immunological characteristics of putative amino acid sequence were predicted by bioinformatics analysis. The complete coding sequence was predicted to encode 433 residues and contain a transmembrane region aa_104-124, with the N terminus outside and C terminus inside. The inside part is quite the functional domain. SWISS-MODEL modulated its 3D structure as a barrel which constitutes of alternatively arranged α helix-β sheet, with the key sites such as substrate binding region, active sites, Mg²⁺-binding sites closely located at the center. The protein contains a potential nuclear localization sequence aa_190-199 and several linear B cell epitopes and CTL T cell epitopes, of which the outside epitope aa_49-57 and inside epitope aa_228-236 are facultative T cell and B cell epitope, and the linear B cell epitope aa_206-213 contains the active center site Glu₂₁₀, suggesting the putative protein is a potential membrane with strong immunogenicity. The complete cds was expressed in Escherichia coli, and the recombinant protein can be recognized by the serum from patient infected with E. granulosus. Reverse vaccinology process identified E. granulosus tegumental membrane protein enolase as vaccine candidate.