γ-促分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对毛细支气管炎模型大鼠气道炎症的影响

为研究γ-促分泌酶抑制剂阻断Notch信号对毛细支气管炎(简称毛支)模型大鼠气道炎症反应的影响,建立毛支大鼠模型并且尾静脉注射γ-促分泌酶抑制剂(MW167)。采用HE染色法观察肺组织病理改变,ELISA方法检测血浆中IL-4、INF-γ的水平,real-time PCR检测肺组织和外周血单个核细胞中IL-4mRNA、IFN-γmRNA的表达,Western blotting检测肺组织中NICD、GATA-3、T-bet的蛋白表达。结果显示,MW167注射组较RSV毛支组病理学改变有所减轻;MW167注射组血浆中IL-4水平较RSV组降低,IFN-γ水平增高;肺组织及外周血单个核细胞IL-4mRNA在MW167注射组表达减弱,IFN-γmRNA表达增强;Notch信号和GATA-3表达降低,T-bet表达增强。以上结果提示静脉注射γ-促分泌酶抑制剂能够抑制毛支模型大鼠的气道炎症,可能对毛支有潜在的治疗价值。     

γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch通路并纠正脑卒中后抑郁大鼠Th17/Treg失衡

目的:探究γ-分泌酶抑制剂DAPT对Notch信号通路和脑卒中后抑郁(PSD)大鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)失衡的影响.方法:SD大鼠采用线栓法结合慢性不可预知性温和应激(CUMS)刺激及孤养建立PSD模型,随机分为PSD组(等量生理盐水)和DAPT组(5 mg/kg DAPT),假手术(sh...     

γ-促分泌酶抑制剂对哮喘小鼠肺组织IL-4表达的影响

目的探讨γ-促分泌酶抑制剂对哮喘模型小鼠肺组织白介素-4表达的影响。方法选取30只BALB/c小鼠,随机分为对照组、哮喘组和γ-促分泌酶抑制剂阻断组。免疫组织化学方法和ELISA方法检测各组小鼠肺组织内IL-4的表达。结果哮喘组小鼠肺组织IL-4的表达水平显著高于正常对照组(0.01),但是在应用γ-促分泌酶抑制剂处理后,哮喘组小鼠肺组织IL-4的表达水平显著下调(0.01)。结论静脉注射γ-促分泌酶抑制剂能降低哮喘小鼠肺组织IL-4的表达。     

γ-分泌酶抑制剂阻断LPA诱导的胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移

目的探讨γ-分泌酶抑制剂MK-0752阻断溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)诱导胃癌细胞SGC-7901的侵袭迁移。方法应用Western blot检测空白组、空白刺激组、实验组、实验刺激组细胞中LPA2、Notch1、Hes-1分子的表达;细胞侵袭迁移实验检测四组细胞的侵袭迁移情况;Western blot检测四组细胞上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)中相关蛋白表达;间接免疫荧光(immunofluorescence microscopy assay,IFA)观察四组细胞的形态学改变。结果实验组细胞LPA2、Notch1、Hes-1蛋白表达比空白组低,且侵袭迁移能力减弱;使用MK-0752预处理的SGC-7901细胞中E-cadherin表达比空白组高,vimentin表达比空白组低;细胞形态学结果表明:MK-0752可抑制LPA引起的SGC-7901细胞形态学改变。结论γ-分泌酶抑制剂可抑制由LPA诱导的胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移,为胃癌的分子靶向治疗提供新的理论依据。     

γ-促分泌酶抑制剂对支气管哮喘模型小鼠肺组织IL-1β和TNF-α表达的影响

目的研究γ-促分泌酶抑制剂阻断Notch信号对支气管哮喘(简称哮喘)模型小鼠肺组织白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化。方法 30只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘组和γ-促分泌酶抑制剂阻断组。制作小鼠哮喘模型,在小鼠激发阶段尾静脉注射γ-促分泌酶抑制剂MWl67。Westernblot和RT-PCR方法检测三组小鼠肺组织内IL-1β和TNF-α蛋白和mRNA的表达变化。结果正常对照组IL-1β和TNF-α蛋白表达的平均光密度值分别为(0.22±0.02)与(0.17±0.01),显著低于哮喘组的小鼠肺组织IL-1β(0.54±0.04)和TNF-α(0.32±0.03)蛋白的表达(P<0.05),而MWl67阻断Notch信号后,MWl67注射组小鼠肺组织IL-1β和TNF-α蛋白表达的平均光密度值分别为(0.38±0.03)与(0.21±0.02),显著低于哮喘组(P<0.05);正常对照组IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达平均光密度值分别为(0.36±0.03)与(0.26±0.02),显著低于哮喘小鼠肺组织IL-1βmRNA(0.82±0.06)和TNF-αmRNA(0.49±0.04)的表达而MWl67注射组分别为(0.58±0.04)与(0.30±0.03),显著低于哮喘组。结论静脉注射γ-促分泌酶抑制剂能抑制哮喘模型小鼠气道炎症反应。     

HBV特异性IFN-γ分泌细胞的体外扩增和功能研究

目的:体外分离扩增HBV多肽特异性IFN-γ分泌细胞,并进行自体扩增,检测其扩增后的多肽特异和IFN-分泌功能。方法:酶联免疫斑点法筛选HBV自然感染献血个体,分离外周血单核细胞,体外刺激并分选IFN-γ分泌细胞,并进行自体细胞体外扩增,流式细胞术检测扩增后细胞的CD4、CD8表型,多肽负载自体淋巴瘤细胞系(lymphoblastoid cell lines,LCLs)细胞检测其多肽特异性和IFN-γ分泌能力。结果:经过4周体外自体扩增,HBV特异性IFN-γ分泌细胞扩增数量达1000多倍,CD4和CD8比例变化不显著,4周扩增后的T淋巴细胞能有效识别HBV特异性多肽并分泌IFN-γ。结论:HBV多肽特异性IFN-γ分泌细胞能在体外有效扩增并保持功能表型不变。     

γ分泌酶抑制剂对乏氧环境下骨肉瘤细胞增殖及侵袭力影响的实验研究

目的探讨乏氧状态下分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitors,DAPT)介导Notch1信号通路对骨肉瘤MG-63细胞系增殖、凋亡、侵袭、转移的影响及相关机制。方法以骨肉瘤细胞株MG-63为研究对象,分为正常组(NC)、乏氧组(Hypoxia)和含有DAPT的乏氧组作为实验组(Hypoxia+DAPT)。采用流式细胞仪检测处理后的细胞周期,CCK-8方法检测细胞的增殖能力,并使用Western Blot检测MG-63细胞株中Notch1、HIF-1、Hes-1蛋白的表达情况,通过Transwell实验来验证其转移能力。同时探讨DAPT在乏氧环境下对细胞增殖和细胞周期方面的影响,分析其介导的Notch1下调情况及其抑制乏氧对MG-63细胞的促增殖作用。结果与正常组相比较,乏氧组细胞的增殖能力及侵袭能力均较正常组有显著的提升,差异具有统计学意义(0.05)。而实验组与乏氧组相比较,分泌酶抑制剂(DAPT)能显著降低其增殖及侵袭能力(0.05)。Western Blot结果显示,与正常组相比,乏氧组和实验组均可上调Notch1、HIF-1、Hes-1相关蛋白的表达;但是与乏氧组对比,实验组可显著下调Notch1、HIF-1、Hes-1蛋白的表达水平(0.05)。流式细胞仪结果显示:与正常组相比,乏氧组和实验组均可促进细胞由G1期转向G2期;而与乏氧组对比,实验组可显著抑制细胞由G1期转向G2期,使细胞周期停滞,差异具有统计学意义(0.05)。增殖实验结果显示,与正常组相比,乏氧组和实验组均可促进细胞增殖;而与乏氧组对比,实验组可显著抑制细胞增殖,差异具有统计学意义(0.05)。结论分泌酶抑制剂可通过下调Notch1通路显著抑制乏氧状态下骨肉瘤细胞株MG-63的增殖与侵袭,阻断Notch1表达可能是潜在的治疗骨肉瘤的机制之一。     

Notch1信号抑制对成骨肉瘤细胞化疗药物敏感性的影响

目的研究抑制Notch1信号对成骨肉瘤细胞化疗药物敏感性的影响及部分机制。方法将人成骨肉瘤细胞系OS-732按γ-分泌酶抑制剂（GSI）作用与否分为GSI组和对照组;脂质体法转染真核细胞表达质粒;Realtime PCR检测NICD、Hes1mRNA表达;流式细胞仪（FACS）检测Annexin V-PE/7-AAD双标的细胞凋亡;MTT法检测化疗药物对细胞的抑制率。结果 GSI组NICD和Hes1 mRNA均较对照组明显降低（P〈0.01）。GSI组化疗药物导致的瘤细胞抑制率和凋亡率均明显高于对照组。过表达Hes1可减弱GSI诱导的瘤细胞化疗药物敏感性增高。结论 GSI通过抑制Notch1受体激活和下游靶基因Hes1表达促进人成骨肉瘤细胞凋亡,从而增加人成骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

γ-促分泌酶抑制剂对脑缺血再灌注小鼠海马CREB表达的影响

目的研究γ-促分泌酶抑制剂MW167阻断Notch信号对脑缺血再灌注小鼠海马cAMP反应元件结合蛋白（CREB）表达的影响。方法72只昆明小鼠随机分为：假手术组（Sham,8只）、γ-促分泌酶抑制剂组（MW167,32只）、缺血再灌注组（I／R,32只）。γ-促分泌酶抑制剂组和I／R组依据缺血后再灌注的不同时间点再细分为1、3、7、14d4个亚组。应用免疫组织化学方法和Westernblot方法检测各组小鼠海马CREB蛋白的表达。结果免疫组织化学方法检测时发现．缺血处理后1d时,CREB表达迅速增高,之后持续激活,与假手术组相比,显著升高（P〈0．01）;与相同时间点的缺血组比较,MW167组的CREB蛋白阳性表达则明显升高（P〈0．05）;Westernblot方法也得到了相同的结论。结论γ-促分泌酶抑制剂很可通过上调CREB蛋白的表达参与脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。     

促分泌酶抑制剂对毛细支气管炎模型大鼠体内Th17 细胞分化的影响

目的:研究酌鄄促分泌酶抑制剂阻断Notch 信号对毛细支气管炎(简称毛支)模型大鼠Th17 细胞发育和分化的影响,为毛支治疗寻找新的药物提供理论基础。方法:按随机对照原则将SD 大鼠分为正常组、毛支组和酌鄄促分泌酶抑制剂组,滴鼻法成功建立毛支模型,而后尾静脉注射酌鄄促分泌酶抑制剂MW167,通过HE 染色观察肺组织病理改变,ELISA 检测血浆中白介素17(IL鄄17)的水平,实时荧光定量PCR 检测肺组织和外周血单个核细胞中ROR酌t mRNA 的表达,Western blot 检测肺组织中Notch 信号、ROR酌t 的蛋白表达。结果:与毛支组相比,MW167 组肺组织病理学改变减轻;血浆IL鄄17 水平也较毛支组降低;肺组织及外周血单个核细胞ROR酌t mRNA 在MW167 注射组表达均减弱;MW167 组肺组织Notch 信号和ROR酌t 蛋白的表达也显著降低。结论:静脉注射酌鄄促分泌酶抑制剂能够通过阻断Notch 信号通路抑制Th17 细胞的分化,缓解毛支模型大鼠的气道炎症,对毛支有潜在的治疗价值。     

单胺氧化酶抑制剂诱导胶质瘤细胞的体外分化

为研究单胺氧化酶抑制剂(TCP)对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞的诱导分化作用,以不同浓度TCP单独或与100nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)联合处理U251细胞。采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化;流式细胞仪检测细胞周期变化;Hoechst 33258染色显示细胞凋亡;Real-time PCR和Western印迹法检测分化相关基因mRNA和蛋白表达水平的改变。结果表明:TCP可诱导细胞突起增多且变细长,抑制细胞增殖,阻滞细胞周期于G1期,抑制全能性转录因子Oct4和Sox2的表达,上调分化标志基因胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,TCP联合TSA也诱导了GFAP的高表达。这些结果提示:TCP可诱导胶质瘤U251细胞分化,TSA对TCP诱导细胞分化有协同作用。     

Notch信号通路调控骨肉瘤细胞增殖的机制研究*

目的 观察Notch通路阻断剂DAPT和Notch通路激动剂Jagged1对人骨肉瘤143B细胞和MG63细胞体外增殖和体内成瘤的影响,探讨Notch信号通路在骨肉瘤细胞增殖中的调控作用。方法 体外培养人骨肉瘤143B细胞和MG63细胞,采用CCK-8法、集落形成试验以及BrdU染色法检测DAPT和Jagged1对两种细胞增殖的影响;在体内利用裸鼠成瘤试验,观察DAPT对于骨肉瘤细胞体内成瘤能力的调控作用,并对肿瘤组织进行切片染色,观察肿瘤组织恶性程度的变化情况。结果 CCK-8法检测结果表明DAPT显著抑制143B细胞和MG63细胞的增殖,且和浓度呈正相关,但10 μM的DAPT与20 μM的DAPT对143B细胞的增殖抑制能力无明显差异。肿瘤集落形成试验结果表明DAPT能够显著抑制肿瘤集落的形成。BrdU染色结果显示DAPT组的BrdU阳性细胞明显少于对照组和Jagged1组,而Jagged1组的阳性细胞数明显多于对照组。体内裸鼠成瘤实验结果显示,与对照组相比,DAPT组能够明显抑制肿瘤大小,Ki67阳性率降低。HE染色结果显示,DAPT组肿瘤组织中的细胞核数量和血管数量明显减少,且组织内部更加疏松。 结论 Notch信号通路参与调控人骨肉瘤143细胞和MG63细胞的体外增殖与体内成瘤行为,抑制Notch通路的表达可能成为骨肉瘤治疗的重要靶点。     

胶质瘤细胞增殖与凋亡的研究

对未经其他治疗的手术摘除的胶质瘤标本,采用免疫组化和原位标记方法研究了胶质瘤及其瘤旁组织中细胞增殖以及凋亡的状况。结果表明,增殖细胞核抗原在世界卫生组织（ＷＨＯ）制定的不同级别的胶质瘤中其阳性率具有显著性差异（Ｐ＝ ０．０００５）,而在胶质瘤与其瘤旁组织之间则无显著性差异。恶性程度不同的胶质瘤中细胞发生凋亡的比率具有显著性的差异（Ｐ＝ ０．０１７０）,而在胶质瘤与其瘤旁组织间无显著性差异。增殖细胞核抗原是划分胶质瘤恶性程度的一个较好的指标,与Ｗ ＨＯ 胶质瘤恶性程度分级具有较好的相关性（ｒ＝ ０．４０８９）。Ｗ ＨＯ Ⅱ级星形胶质瘤细胞凋亡明显增多,可能是保留了恶性程度较高的胶质瘤细胞而清除了恶性程度相对较低的胶质瘤细胞,从而可能促进了胶质瘤的恶性进展。胶质瘤邻近的瘤旁组织可能已具有了胶质瘤的某些特性,胶质瘤呈浸润性生长可能与此有密切的关系。     

咖啡因对体外培养U251人胶质瘤细胞的影响

目的观察咖啡因对体外培养U251神经胶质瘤细胞存活及凋亡的影响。方法采用MTT和Annexin V/PI流式细胞法观察不同浓度和作用时间的咖啡因对U251神经胶质瘤细胞的影响。结果 (1)咖啡因在体外可以抑制U251人胶质瘤细胞的存活;(2)咖啡因在体外使U251细胞早期凋亡发生的时间较晚,且在1~10 mmol/L浓度范围内,出现浓度依赖性瘤细胞早期凋亡增加,大于10 mmol/L时,瘤细胞迅速出现大量坏死。结论实验初步证明了咖啡因在体外可以抑制U251人胶质瘤细胞的增殖活性并在一定浓度范围内(1~10 mmol/L)可促使其凋亡,为进一步的动物实验及新药开发提供实验依据。     

反义hTERT/PTEN联合基因治疗恶性胶质瘤的体内外研究

目的探讨腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合基因转染对恶性胶质瘤细胞生长的影响。方法用细菌内高效同源重组系统构建的含有hTERT反义序列及野生型PTEN的腺病毒在体内外单独或联合转染恶性胶质瘤细胞系U251，检测肿瘤细胞生长情况、端粒酶活性、蛋白表达、细胞周期变化等。结果在体外试验中单独或联合转染都能明显抑制肿瘤细胞的生长，以联合转染效果最明显，转染后第6天联合转染组的细胞生存率为37．6％，端粒酶活性水平和hTERT蛋白表达水平明显下降，分别为28．8TPG、0．2106，PIEN蛋白表达水平上升为0．9630；在体内试验中肿瘤生长也明显减慢。结论腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合转染能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。     

Notch信号通路调控上皮-间质转化影响膀胱癌侵袭性和耐药性

目的体外探讨Notch信号通路对膀胱癌细胞侵袭性与耐药性的影响及分子机制。方法采用Notch信号通路受体完全阻断剂(γ分泌酶抑制剂)处理膀胱癌T24、5637和J82细胞48 h后,倒置显微镜观察膀胱癌细胞增生及形态;用RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平检测上皮-间质转化(EMT)分子标志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Alpha-smooth muscle actin的表达;MTT、Transwell检测膀胱癌细胞耐药性及侵袭能力。结果完全阻断Notch信号通路后,镜下显示膀胱癌细胞形态变小,细胞分散;EMT分子标志物E-cadherin mRNA和蛋白水平表达上调(P0.05),N-cadherin、vimentin、Alpha-smooth muscle actin mRNA和蛋白水平表达下调(P0.05);膀胱癌细胞T24、5637和J82增殖明显被抑制(P0.05);膀胱癌细胞T24、5637和J82穿过微孔膜的细胞数明显减少(P0.05)。结论 Notch信号通路可通过调控EMT的变化而改变膀胱癌的侵袭性与耐药性。     

胸腺嘧啶激酶/丙氧鸟苷体外杀伤携带胸腺嘧啶激酶基因的C6胶质瘤细胞时细胞凋亡的检测

目的检测胸腺嘧啶激酶基因转染C6胶质瘤细胞后用丙氧鸟苷处理时细胞凋亡的发生。方法用脂质体介导的基因转染将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因转入C6胶质瘤细胞中,用G418筛选,建立稳定表达胸腺嘧啶激酶的C6细胞株;加入丙氧鸟苷作用不同时间,用原位末端标记、透射电镜和DNA凝胶电泳法检测。结果用丙氧鸟苷作用72h发现有大量原位末端标记阳性的细胞,阳性信号呈块状或半月形位于核膜内侧;透射电镜发现肿瘤细胞核内染色质呈块状或帽状位于核膜内侧,非染色质部分呈空泡状,细胞质有的固缩,细胞器基本保持完整;有的则高度肿胀,细胞内亚单位遭到破坏;DNA凝胶电泳发现用丙氧鸟苷作用72h细胞基因组DNA呈梯状带。结论实验结果提示胸腺嘧啶激酶/丙氧鸟苷系统作用于表达胸腺嘧啶激酶的C6细胞时该细胞主要是以凋亡的方式死亡的。     

胸腺嘧啶激酶／丙氧鸟苷体外杀菌携带腺嘧啶激酶基因的C6胶质瘤？…

目的：检测胸腺嘧啶激酶基因转染Ｃ６胶质瘤细胞后用丙氧鸟苷处理时细胞凋亡的发生。方法：用脂质体介导的基因转染将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因转入Ｃ６胶质效率细胞中，用Ｇ４１８筛选，建立定表达胸腺嘧啶激酶的Ｃ６细胞株，加入丙氧鸟苷作用不同时间，用原位末端标记、透射是和ＤＮＡ凝胶电泳法检测。结果：用丙氧鸟苷作用７２ｈ发现有大量原位末端标记阳性的细胞，阳性信号呈块状或半月形位于核膜内侧，透射电镜发现肿瘤细胞     

姜黄素联合抗TfR抗体体外抗胶质瘤效应研究

目的探讨抗转铁蛋白受体(Tf R)抗体联合化疗药物姜黄素的抗瘤效应。方法利用MTT方法检测Tf R抗体与姜黄素单独及联合作用对胶质瘤细胞生存率的影响;利用流式细胞仪检测Tf R抗体与姜黄素单独及联合作用对胶质瘤细胞凋亡、细胞增殖和细胞周期的影响。结果 Tf R抗体与姜黄素联合作用可增强对胶质瘤细胞增殖的抑制作用,促进肿瘤细胞坏死,并将肿瘤细胞有效阻滞在S期。结论抗Tf R抗体可协同增强姜黄素对胶质瘤细胞的生长抑制效应。     

树突状细胞及exosomes体外诱导抗脑胶质瘤细胞毒活性的研究

目的探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞（DCs）及其衍生exosomes诱导T细胞活化和特异性肿瘤杀伤的作用。方法将患者静脉血单个核细胞经GM—CSF、IL-4诱导产生DCs,收集培养上清液,超速离心法制备exosomes。流式细胞术检测DCs表面标志表达,用SDS-PAGE和western—blot检测exosomes携带MHC和共刺激分子的情况。MI]r法观察DCs及exosomes对T细胞促增殖作用和CTL体外杀伤活性。结果肿瘤抗原致敏的DC高表达MHC—I、MHC-Ⅱ、CD54、CDS0和CD86,与抗原致敏前相比有显著差异,P〈0．05。DC衍生的exosomes表达MHC-Ⅱ、CD54和CD86,并显著引起T细胞扩增和细胞毒效应,与对照组相比有显著差异,P〈0．01。结论从脑胶质瘤患者静脉血诱导出高表达MHC和共刺激分子的DCs以及exosomes,具有活化T细胞并产生特异性细胞毒活性的功能,有望成为临床治疗脑胶质瘤有效的新疫苗。