miRNA 表达与免疫细胞因子相关性在原发性肝癌早期诊断和预后中的作用

目的:检测miR-146a、miR-224、miR-34c、miR-200a、miR-148b、miR-375 六种miRNAs 在原发性肝癌中的表达变化及其与HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和IL-12、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等炎症因子表达的相关性,以验证循环miRNA 是否可作为理想的血源性新型生物标志物用于原发性肝癌的早期检测。方法:收集肝炎、肝硬化患者及健康对照组静脉血,并收集原发性肝癌患者癌组织和癌旁组织。提取总RNA 后通过实时定量PCR 检测并比较各组miRNA 的相对表达水平,同时检测miRNA 表达水平变化与血清肿瘤标志物AFP、CEA、CA19-9、CA125 表达的关系;并检测miRNAs 表达水平变化与HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和炎症因子IL-12、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α表达相关性。结果:相对于健康组,miR-34c、miR-224、miR-146a 在PHC 组血清和组织中表达显著上调;miR-200a、miR-148b、miR-375 在PHC 组血清和组织中表达显著下调,差异具有统计学意义。HBsAg 与血清miR-375 和miR-146a 存在回归关系,miR-375 随HBsAg 表达水平升高而降低,而miR-146a 随HBsAg 表达升高而升高。IFN-γ与miR-146a 存在回归关系, miR-146a 随IFN-γ表达水平降低而升高,miR-375 和miR-146a 诊断能力大于CA19-9 和AFP。结论:miR-146a、miR-224、miR-34c、miR-200a、miR-148b、miR-375 在原发性肝癌血清和组织中存在表达差异,其中miR-375 和miR-146a 诊断能力优于AFP 和CA19-9,血清miR-375 和miR-146a 可能成为新的肝癌早期诊断标志。     

胃癌组织中microRNA的差异表达

目的 检测胃癌组织和癌旁组织中microRNA (miRNA)的差异表达.方法 收集经病理确诊为胃癌进行外科手术切除的25例患者的胃癌组织及距离胃癌病灶5 cm以上的癌旁组织,选取其中7例标本提取总RNA,应用Illumina miRNA芯片检测胃癌和癌旁组织中差异表达的miRNA.应用定量实时PCR技术验证25例胃癌和癌旁组织标本中差异表达的miRNA,并分析25例患者的临床病理与胃癌组织中miRNA差异表达的关联.结果 Illumina miRNA芯片检测显示,HS-138,HS-153,HS-157在胃癌组织中表达下调,miR-181a,miR-21,miR-21*,miR-27a,miR-584,miR-93在胃癌组织中表达上调.定量实时PCR显示,与癌旁组织比较,胃癌组织中miR-181a表达上调(56.848±135.551比3.950±12.101,P＜0.05),而miR-584在胃癌和癌旁组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05).胃癌组织miR-181a表达与患者胃癌淋巴结转移及年龄有关联(rp=0.462、0.414,P=0.009、0.023),与性别和病理分型无关联(P=0.220、0.106).结论 应用miRNA芯片技术和荧光定量PCR技术发现了胃癌组织中差异表达的miRNA.     

Cdc25a在跨种属肝癌组织中的表达及其意义*

 目的：研究细胞周期通路中的细胞分裂周期蛋白25a (Cdc25a)在人、大鼠和树鼩不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键基因研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Cdc25a mRNA和蛋白表达水平。结果：Cdc25a mRNA表达水平在人、大鼠和树鼩的肝癌组织中均高于正常肝组织（均P<0.05）;在人和大鼠肝癌组织中的表达高于其对应的癌旁组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Cdc25a mRNA在人肝癌组织中的表达水平与病人的临床分期、门脉癌栓及肝外转移明显相关,而与术后复发、肿瘤直径、肿瘤个数、血清甲胎蛋白水平和肿瘤分化无明显关系。Western blotting检测结果显示Cdc25a在人、大鼠和树鼩肝癌组织中的蛋白表达水平均较癌旁和正常肝组织显著上调。结论：Cdc25a有可能是影响肝癌发生和发展的重要分子之一,跨种属筛选肿瘤关键基因策略可能有助于发现肝癌关键基因。     

TLR2和TLR4在原发性肝癌中的表达

目的：本研究通过检测原发性肝癌Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的表达，分析其与临床病理生理因素的关系，探讨TLR2，TLR4在原发性肝癌疾病过程中的可能作用。方法：采用免疫组化法和实时荧光定量PCR分别在蛋白水平及mRNA水平检测原发性肝癌组织和配对癌旁组织TLR2、TLR4的表达。结果：原发性肝癌组织在蛋白水平和mRNA水平TLR2和TLR4的表达均明显低于癌旁组织（P<0.01）。但免疫组化结果显示不论是肝癌组织还是癌旁组织，TLR2和TLR4的表达均明显高于正常肝组织（P<0.01，P<0.05），有门静脉分支癌栓的患者癌组织TLR4的表达强度低于无门静脉分支癌栓的患者（P<0.05）。结论：肝癌组织TLR2和TLR4的表达与癌旁组织相比受到相对抑制，但高于正常肝组织，TLR2和TLR4信号途径可能参与了原发性肝癌的病理过程。     

可溶型B7-H3在原发性肝细胞癌患者血清中的表达及临床意义

目的 检测协同刺激分子B7-H3在肝细胞癌患者血清及组织中的表达,并探讨其临床意义.方法 选取原发性肝细胞癌63例患者的癌组织和血清标本;5例肝血管瘤的瘤旁组织作为正常肝组织对照;同期收取50例健康体检人员外周血标本为正常对照.采用ELISA检测肝癌患者和正常人血清中可溶型B7-H3(sB7-H3)的含量,免疫组化检测正常肝组织和肝细胞癌组织中B7-H3的表达.结果 肝细胞癌患者外周血清sB7-H3含量为(4143.47±976,27) pg/mL,显著高于正常对照组(2076.18±605.42)pg/mL(P ＜0.05);且其表达水平与临床分期,是否远处转移及肝癌组织中是否阳性表达B7-H3等参数有关(P＜0.05),与年龄、性别、组织学类型、淋巴结转移及肿瘤大小等临床病理参数无关;与血清学指标CA19-9呈明显正相关(P＜0.05),但与AFP和CEA水平无相关性.结论 肝癌患者血清中sB7-H3表达明显高于正常人,B7-H3表达与疾病临床病理指标相关,表明检测sB7-H3可能对原发性肝癌的诊断有一定价值.     

基于肿瘤组织与血清miRNA表达数据的肝癌诊断模型构建

目的 探究肝癌患者组织及血清中共同差异表达的miRNA,构建肝癌诊断模型.方法 从美国国立生物技术信息中心数据库(Gene Expression Omnibus)下载芯片数据,从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)下载肝癌及正常样本的miRNA表达数据和mRNA表达数据,利用R软件进行差异分析;LASSO-logistic回归分析构建肝癌miRNA诊断模型;ROC曲线评价模型的预测效果;最后在40例肝癌患者及40例健康者血清中通过实时定量荧光PCR检测关键差异miRNA的表达.结果 共筛选出36个同时在肝癌患者组织及肿瘤血清中均差异表达的miRNA,包括31个上调miRNA和5个下调miRNA.GO分析显示差异miRNA主要富集在胞质、胞核区域,参与包括转录因子活性调节、γ-干扰素等多种信号通路的转导.进一步经LASSO-logistic回归构建含有8个 miRNA(hsa-miR-139-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-let-7c-3p、hsa-miR-30c-1-3p)的诊断模型,ROC曲线显示该诊断模型在训练集、测试集以及GSE112264及GSE113486数据集中曲线下面积分别为0.992、0.997、0.953、0.916.收集临床样本检测得到肝癌患者组血清中关键差异miRNA的表达显著高于对照组(P＜0.05).结论 由8个同时在肝癌患者血清及肿瘤组织中均差异表达的miRNA构成的诊断模型在鉴定肝癌与正常样本中具有良好的区分效果,对于肝癌患者的早期诊断提供借鉴意义.     

肺腺癌中miRNA34a和c-myc的表达及意义

目的检测肺腺癌组织中miRNA34a,癌基因c-myc的表达,探讨两者之间的关系及意义。方法采用qRT-PCR法检测mRNA miRNA34a,Western blot、免疫组化法检测c-myc蛋白在正常肺组织、癌旁肺组织、肺腺癌以及转移癌组织中的表达。结果(1)miRNA34a在肺腺癌组织中呈低表达,低于癌旁和正常肺组织(P0.01),高于转移癌组织(P0.01)。c-myc在肺腺癌组织中呈高表达,高于癌旁和正常肺组织(P0.01),低于转移癌组织(P0.01)。miRNA34a及c-myc在癌旁组织和正常肺组织之间的表达差异有统计学意义(P0.05)。(2)病理类型:miRNA34a及c-myc在低分化和高分化肺腺癌之间的表达差异均无统计学意义(P0.05)。两者在转移癌与非转移肺腺癌组织中的表达差异有统计学意义(P0.05)。(3)预后分析:cmyc阳性组的肺腺癌患者生存率低于阴性组(P0.05),miRNA34a低表达组患者的生存时间明显低于高表达组,差异有统计学意义(P0.01)。结论肺腺癌组织中miRNA34a的表达与c-myc蛋白表达呈负相关。c-myc高表达miRNA34a低表达提示患者预后不良。     

人肝癌组织中EpCAM的表达及其意义

目的探讨EpCAM在肝细胞癌中的表达及其临床意义,为获取肝癌诊断相关的蛋白分子提供实验资料。方法采用组织芯片和免疫组化技术检测EpCAM在肝癌组织、癌旁组织及其癌旁正常组织中的表达。结果 EpCAM在肝癌组织、癌旁组织、癌旁正常组织中的阳性率分别为81.7%(49/60)、61.7%(37/60)、0,三组间差异有统计学意义(P0.01)。肝癌组织中EpCAM高表达与临床分期、病理分级和民族相关(P0.05),与患者年龄、肿瘤直径、AFP值、包膜完整度和门脉瘤栓无关(P0.05)。EpCAM阳性肝癌患者的生存期短于阴性患者,但两组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 EpCAM在肝癌组织中表达上调,其可能参与原发性肝癌发生、发展的恶性进程。     

原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞受体表达及意义

目的:通过研究原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞表面受体活化性及抑制性受体的表达,分析探讨这两种受体含量变化在原发性肝癌发生发展中的关系及其临床价值。方法:通过流式细胞术及免疫组织化学方法检测52例原发性肝癌组织及其癌旁组织中NK细胞数及其活化性、抑制性受体的表达,并结合临床相关因素进行统计学分析。结果:原发性肝癌的NK细胞数量明显低于癌旁对照组(P<0.01),原发性肝癌组织活化性受体NKG2D、NKP44明显低于癌旁组织(P<0.05),而抑制性受体CD158b、CD159a明显高于癌旁组织(P<0.05)。NKG2D、NKP30、NKP44的表达与肝癌临床分期负相关,即在早中期的患者含量较高,越晚期患者肝癌组织中NKG2D、NKP30、NKP44含量越低(P<0.05),NK细胞中抑制性受体CD158b、CD159a的含量在越晚期患者肝癌组织中含量越高(P<0.05)且与AFP高低有关及HBsAg的感染有联系。而NK受体的表达在是否有远处转移、肿瘤分化程度之间以及不同的病灶大小之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:原发性肝癌发病可能与NK细胞减低及NK细胞活化性受体表达降低、抑制性受体表达升高有关。     

结缔组织生长因子在慢性肝病诊断中的应用研究

探讨结缔组织生长因子(CTGF)在慢性肝病诊断中的应用价值。运用ELISA方法检测198例研究对象,观察血清CTGF水平的变化,分析CTGF水平与临床特征及实验室指标的相关性;运用实时荧光定量RT-PCR方法检测组织中CT-GF mRNA的表达量,比较各组间表达量的变化。乙肝后重度肝纤维化组、肝硬化组、原发性肝细胞癌(HCC)组的血清CTGF水平均显著高于正常对照组,且具有统计学意义(P<0.05);血清CTGF水平与部分临床实验室特征存在相关性,在区分早晚期肝纤维化上具有诊断提示作用;癌旁组织的CTGF mRNA相对表达量显著高于正常对照和癌组织的表达量且具有统计学差异(P<0.05)。血清CTGF水平与肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生发展关系密切,有望成为一个新的无创性肝纤维化检测诊断指标,为临床诊断提供依据。     

血清GP73检测在原发性肝癌诊断中的作用

目的 检测血清中高尔基体蛋白73（GP73水平）,分析GP73指标对于原发性肝癌诊断的作用,探讨血清GP73水平和AFP联合检测对原发性肝癌诊断的临床价值.方法 采用酶联免疫吸附试验（E LISA）定量检测60例体检正常者,128例慢性肝炎和肝硬化（CH/LC）患者和96例原发性肝癌（PHC）患者血清中的GP73,同时采用电化学发光法检测血清中AFP的水平.结果 经统计分析,正常对照组、CH/LC组和PHC组GP73表达水平的差异有统计学意义（P＜0.05）.GP73的敏感度和特异性分别为91.67％和95.21％,AFP的敏感度与特异度分别为73.96％和87.23％.GP73和AFP联合检测时敏感度与特异性分别为96.52％和87.46％.结论 GP73对PHC的诊断有较好的敏感度和特异性,血清GP73联合AFP检测能够有效地提高PHC的诊断效率,可用于PHC高危人群的普查.     

联合检测血清CA153、CA125、CA199对乳腺癌的临床意义

目的探讨血清CA153、CA125、CA199联合检测对乳腺癌早期诊断的价值。方法采用化学发光法分别检测乳腺癌、乳腺良性疾病患者、体检健康者血清中CA153、CA125、CA199的水平。结果乳腺癌患者血清CA153、CA125、CA199水平均显著高于正常组和良性乳腺疾病组，差异有统计学意义（P〈0.01）；乳腺癌患者术后CA153、CA125、CA199含量较术前显著性下降（P〈0．01），与正常组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。CA153、CA125、CA199单独检测乳腺癌的灵敏度分别为54％、36％、30％，特异性为96．6％、91．6％、93．2％．准确性为84、2％、75．1％、74-8％。三者联合检测乳腺癌的灵敏度为78．0％、特异性为88．1％、准确性为85．2％。三项联合检测与单独检测相比灵敏度明显提高（P〈0．05）。结论联合检测血清标志物CA153、CA125、CA199的阳性率、敏感性有较大幅度的提高．三项标志物虽不能作为乳腺癌的特异性指标，但可为临床早期发现、诊断乳腺癌提供十分重要的依据。     

CYFRA21—1在原发性肝癌诊断中的应用

目的探讨血清肿瘤标志物CYFRA21-1检测原发性肝癌（primary hepatic cancer,PHC）的诊断价值。方法2003年7月至2007年12月收治的330例肝病患者。其中组织病理学诊断为原发性肝癌者192例,非原发性肝癌者138例。采用电化学发光免疫分析法对330例肝病患者的血清CYFRA21-1水平进行检测。结果血清CYFRA21-1水平PHC组为（9．73±1．02）ng／mL,非PHC患者为（1．33±0．26）ng／mL,两组间差异具有统计学意义（P〈0．01）,不同组织学分型的PHC患者血清CYFRA21—1水平之间的差异也具有统计学意义（P〈0．01）。结论检测血清中CYFRA21-1水平对HPC的诊断有一定的指导意义。     

甲胎蛋白和GGT-Ⅱ联合检测在肝癌患者诊断中的意义

目的：探讨两种肝癌标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）和γ-谷氨酰转移酶同工酶Ⅱ（γ-glutamyltransferase isoenzymeII,GGT-Ⅱ）单独检测和联合检测原发性肝癌（primaryhepatocellularcar cinoma,PHC）的早期诊断价值。方法：GGT-Ⅱ检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,AFP检测采用电化学发光免疫分析法。分别对33例乙型肝炎患者,30例肝炎后肝硬化患者,44例原发性肝癌患者以及35名健康体检者进行GGT-Ⅱ和AFP检测,综合分析2项指标对PHC的诊断价值。结果：PHC组的GGT-Ⅱ和AFP的阳性率均明显高于肝硬化组、肝炎组和健康对照,差异有统计学意义（P〈O．01）,联合检测敏感性高于单一检测指标。结论：血清GGT-Ⅱ及AFP联合检测可提高PHC的诊断灵敏度,提高肝癌的早期检出率。     

原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数及其转录和蛋白表达水平的研究

目的 检测原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数及其转录和蛋白表达水平,研究宿主免疫调节因子PD-1基因拷贝数差异与肝癌的相关性.方法 采用实时荧光定量PCR法检测24例原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数和外周血单个核细胞PD-1 mRNA表达水平,采用流式细胞术检测外周血CD8+T细胞PD-1蛋白表达水平.对照组为26例血清抗-HBs阳性健康者.结果 肝癌组和对照组PD-1基因单拷贝率分别为34.62％和4.17％,多拷贝率分别为61.54％和95.83％,两组间分布差异有统计学意义(x2 =7.639,P=0.006),肝癌组人群PD-1基因多倍体率显著高于对照组.PD-1mRNA表达平均值对照组为2.35E-03,肝癌组为1.23E-03,Mann-whitey检验比较两组间表达差异有统计学意义,肝癌组明显低于健康对照组(U=153,P=0.009);CD8+T细胞PD-1蛋白表达频率对照组(3.72±0.32),肝癌组PD-1表达频率(16.13±1.68),肝癌组PD-1表达比健康对照组高,差异有统计学意义(t=-7.073,P=0.000).结论 PD-1基因多拷贝可能是HBV感染者发生肝癌的高危因素.PD-1基因拷贝数差异与原发性肝癌的关系值得进一步研究.     

血清标志物GP73在原发性肝癌诊断中的作用

目的分析GP73在原发性肝癌诊断中的作用,探讨血清GP73和AFP联合检测对原发性肝癌诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测60例体检正常者（正常对照）、178例慢性肝炎或肝硬化（CH／LC）患者和194例原发性肝癌（PHC）患者血清中的GP73,同时采用电化学发光法检测血清中AFP的水平。结果经Kruskal—Wallis检验正常对照组、CH／LC组和PHC组GP73表达水平的差异有统计学意义（P〈0．001）且PHC组的GP73水平明显高于CH／LC组（P〈0．001）。以ROC曲线确诊PHC的GP73临界值为190．7ng／ml,AFP的临界值为35．2ng／ml,单项检测时,GP73的敏感度和特异度分别为66．5％和86．6％,AFP的敏感度与特异度分别为58．8％和83．7％。GP73和AFP联合检测时敏感度与特异度分别为85．6％和81．5％。结论GP73对PHC的诊断有较好的敏感度和特异性,血清GP73联合AFP检测能够有效地提高PHC的诊断效率。     

心房颤动患者心房组织中差异表达miRNA的初步研究

目的：应用基因芯片技术研究心房颤动（房颤）患者心房组织中miRNA的表达谱,分析差异表达的miRNA,为进一步研究miRNA在房颤发生、发展中的作用奠定基础。方法：采用miRNA基因芯片技术检测房颤患者和非房颤患者心房组织样本中miRNA的表达水平;采用实时定量PcR（quantitativereal,timePCR,qRT．PCR）对部分差异表达的miRNA进行验证。结果：MiRNA基因芯片分析结果显示,与非房颤组织相比,房颤组织中差异表达的miRNA共有26个,其中16AmiRNA表达上调,10个miRNA表达下调。qRT．PCR验证结果与芯片结果相一致。结论：MiRNA在房颤患者心房组织中存在差异性表达。     

转录因子EGR-3在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的研究早期生长反应基因(EGR-3)在肝癌组织中的表达,并探讨其在肝癌发生发展中的作用。方法选取125例肝癌及癌旁组织、5例正常肝组织标本,采用免疫组织化学方法检测标本中EGR-3的表达分布,并分析其与肝癌临床病理因素的关系。另提取15例新鲜肝癌及相应癌旁组织标本和人肝癌HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721、FHCC98细胞的总蛋白,采用蛋白质印迹法检测EGR-3的表达水平。结果①免疫组织化学检测结果显示,EGR-3在肝癌组织中的表达阳性率(30/125,24%)明显低于癌旁组织(100/125,80%)(χ2=72.5,P0.001);EGR-3主要表达于肝癌组织的细胞质中,而在癌旁组织的细胞质和细胞核均有表达;此外,EGR-3在肝癌组织中的表达强弱与患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤分化程度等均无明显相关性(P0.05);②蛋白质印迹技术检测结果也显示EGR-3在肝癌组织中的表达水平均明显低于相应癌旁组织(P0.05);EGR-3在4种肝癌细胞系中都有表达,并在HepG2.2.15细胞中表达水平最高。结论 EGR-3在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织,推测其与肝癌的发生密切相关,为肝癌的临床诊断提供了线索。     

CEA、CA15-3和CA125对乳腺癌的诊断价值以及影响因素探讨

研究肿瘤标志物CEA、CA15—3和CA125对乳腺癌的诊断价值,并对影响肿瘤标志物阳性率的相关因素进行分析。采用CLIA法测定血清CEA、CA15—3和CA125水平,以CEA〉4．8μg/mL、CA15-3〉25U／mL、CA125〉35U／mL作为诊断阳性标准。乳腺癌组患者59例,乳腺良性组患者69例,对照组65名。结果表明：乳腺癌CEA,CA15—3和CA125水平较对照组和乳腺良性组明显升高（P〈0．05）。CA15-3的灵敏度（42．4％）最高,CA125的特异度（89．6％）最高。采用平行联检法,可提高乳腺癌诊断的灵敏度（67．8％）和阴性预测值（85．0％）。而采用系列联检法,可提高特异度（91．0％）和阳性预测值（58．6％）。与乳腺癌肿瘤标志物阳性率显著相关的因素有：肿瘤分期、皮肤改变、淋巴转移、远处转移和P53（P〈0．05）。