人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgECε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用．并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT—PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgECε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a（＋）构建原核表达载体IgECε3-Cε4-pET28a（＋）,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达IgECε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定：用表达蛋白免疫BALB／c小鼠,制备抗鼠血清,用Western—blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgECε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量（Mr）同预期的结果相一致;IgECε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgECε3-Cε4-pET28a（＋）表达载体,获得了能被人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基特异性识别的IgECε3-Cε4区蛋白．并用天然人血清IgE鉴定了多克隆抗体,为下一步单克隆抗体的制备打下了基础。     

人IgE Cε3-Cε4蛋白的表达、复性、纯化及初步鉴定

目的：获得IgE Fc段的Cε3-Cε4重组蛋白（E34）方法：以RT—PCR技术扩增IgE=Cε3-Cε4（E34）rDNA片段．构建原核表达载体。以其转化大肠杆菌BL-21，诱导表达主要以包涵体形式存在的目的蛋白。经复性、纯化后，用Western blot和ELISA法初步鉴定所获E34蛋白与抗人IgE mAb的结合能力结果：对克隆的E34基因片段测序表明，与已报道的序列相一致。获得的可溶性E34蛋白经SDS—PAGE鉴定显示，其相对分子质量（Mr）同预期的结果相一致。Western blot和ELISA法进一步证实，E34蛋白能够被鼠抗IgE mAb特异性识别。结论：成功地构建了pET28a（＋）-E34表达载体，并获得能被抗IgEmAb特异性识别的可溶性蛋白E34，为下一步的工作打下了基础。     

FcεRⅠ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基，并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεRⅠα蛋白基因，经T-A克隆、亚克隆至pET28a（＋）原核表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL．21．STAR（DE3），IPTG诱导表达FeaRIOt亚基蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白；并用其免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗FeaRIOt亚基单克隆抗体，用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因，且测序正确；构建原核表达质粒FcεRⅠα-pET28a（＋）；成功建立4株稳定分泌抗FcεRⅠα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为G101、C22、G113、G42。通过细胞免疫荧光实验证实，4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基。结论成功利用基因重组技术制备了FcεRⅠα亚基蛋白，制备了4株效价高、特异性好的抗FcεRⅠα亚基单克隆抗体，为FcεRⅠα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

变应性鼻炎IgE高亲和力可溶型Fc段受体1α(sFcε1α)蛋白的制备及血清中相应抗体的检测

目的构建人可溶型Fc段受体1α(s FcεR1α)的原核表达载体,诱导表达并纯化重组FcεR1α胞外区段蛋白,检测其与血清中Ig E的结合力及相应抗体的含量。方法应用巢式PCR技术获得人FcεR1α胞外区段基因,构建原核表达载体p ETs Fcε1α,最佳诱导条件表达出s FcεR1α,采用亚胺二乙酸His标签纯化树脂纯化并进行Western blot法鉴定。ELISA检测人s FcεR1α与血清中Ig E的结合力及血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E及抗FcεR1α自身抗体的含量。结果扩增出人FcεR1α胞外区段基因,大小为600 bp左右。p ET-s FcεR1α经PCR、双酶切、测序鉴定正确。诱导表达、纯化出人s FcεR1α,相对分子质量(Mr)大小约为42 000。Western blot法鉴定为人s FcεR1α。人s FcεR1α可以与人血清中Ig E结合。变应性鼻炎(AR)患者血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E含量均低于正常人,抗FcεR1α抗体含量高于正常人。结论获得人s FcεR1α,s FcεR1α与人血清中Ig E有较强的结合力,AR患者血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E含量均低于正常人,抗FcεR1α抗体含量高于正常人。     

氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT-PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST-PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。结果 RT-PCR扩增出336 bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε,质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致。将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清;ELISA效价1∶16 000以上;Western blot结果显示,该抗血清与原核表达的GST-PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。结论在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础。     

人IgE-Fc结构域的基因克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的通过制备小鼠抗人IgE单克隆抗体,为过敏性疾病的研究及诊断打下基础。方法以CRL8033细胞的cDNA为模板扩增人IgE Fcε3-4段基因序列并将其连接到p ET-32a(+)载体中,转化BL21(DE3)大肠杆菌并进行表达。然后将表达所得包涵体进行变复性,把复性所得蛋白进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化效果。最后将纯化的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,经三次免疫后取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合。用ELISA法筛选出能结合人IgE蛋白的阳性克隆,并应用ELISA、Western blot等手段对杂交瘤所分泌单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功构建p ET-32a(+)-IgE Fcε3-4载体并纯化IgE Fcε3-4蛋白。用该蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功制备了杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能够特异性结合人IgE蛋白,可用于ELISA、Western blot等手段对人IgE的检测。结论成功获得了可用于特异性检测人IgE蛋白的单克隆抗体,为人IgE的检测及哮喘等过敏性疾病的研究、诊断及治疗奠定了基础。     

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化

目的:探讨人FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白的原核表达纯化及其在体外与IgG的结合活性。方法:PCR方法从人的外周血白细胞中扩增出huFcγRⅠORF区全长基因并与T载体链接,从克隆载体huFcγRⅠ-T中扩增huFcγRⅠ胞外区基因,并将其装入原核表达载体pGEX-6p-1。构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:扩增到了huFcγRⅠ的胞外区基因,所构建的pGEXhuFcγRⅠ重组质粒经PCR和酶切鉴定与预期一致。IPTG诱导下目的蛋白的表达率约为30%。SDS-PAGE结果显示表达的目的相对分子质量(Mr)56 700与理论预期值一致。West-ern blot结果显示原核表达的huFcγRⅠ胞外区蛋白与人IgG特异亲和。结论:FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白在原核表达系统中得到有效的表达,复性蛋白在体外与人的IgG特异结合。     

白斑综合症病毒极早期蛋白IE3的原核表达、纯化和鉴定

目的:构建对虾白斑综合症的极早期基因IE3的原核表达载体,制备纯化重组蛋白IE3。方法:以感染白斑综合症病毒的对虾心脏组织为模板,PCR法扩增极早期基因IE3基因的编码序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-4T-2-IE3。质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-IE3融合蛋白,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:PCR产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是IE3,DNA序列测定进一步证实与GenBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-IE3,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约33000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2-IE3,并表达出重组蛋白GST-3。为进一步研究对虾白斑综合症的防治提供了平台。     

鸡C/EBP-α基因表达载体的构建及抗血清制备

目的:构建鸡C/EBP-α基因原核和真核表达载体及制备高效价的抗血清,为在蛋白质水平研究鸡C/EBP-α基因的功能以及与其他脂肪细胞分化调控基因间的时空协同关系奠定基础。方法:采用RT-PCR的方法,根据已知鸡的C/EBP-α基因cDNA序列,获取鸡C/EBP-α基因的cDNA片段,测序正确后分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中。重组质粒pGEX-4T-1/C/EBP-α转化大肠杆菌BL21(DE3),不同浓度的IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测蛋白表达情况;真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α应用水压转染法,经RT-PCR检测外源C/EBP-α基因在小鼠肝脏中的表达情况,然后采用"DNAprime-protein boost"策略免疫小鼠,制备高效价的抗血清,应用Western blot检测抗血清的特异性。结果:构建了鸡C/EBP-α基因的原核和真核表达载体;SDS-PAGE显示C/EBP-α得到了特异性的表达;RT-PCR结果提示C/EBP-α mRNA在小鼠肝脏中表达;ELISA和Western blot结果表明基因免疫小鼠产生了高效价和特异性强的抗血清。结论:成功构建了鸡C/EBP-α基因的原核pGEX-4T-1/C/EBP-α和真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α,外源基因C/EBP-α mRNA能在小鼠肝脏中有效表达,同时制备了高效价、特异性强的抗血清。     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.     

The expression, renaturation, purification and preliminary identification of human IgE Cepsilon3-Cepsilon4]

AIM: To gain recombinant protein Cepsilon3-Cepsilon4 of IgE Fc (E34). METHODS: We cloned the gene coding human IgE Cepsilon3-Cepsilon4 (E34) and constructed an expression vector pET28a(+)-E34. The target protein was expressed as inclusion body in E.coli BL-21. Following renaturation and purification through a CM sephorose FF column, the soluble protein was acquired, and its binding ability to murine anti-hIgE mAb was identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The cloned E34 gene was sequenced and proved by SDS-PAGE to be the same as reported sequence. SDS-PAGE analysis showed the relative molecular mass of E34 protein obtained was correct as predicted. Western blot and ELISA data revealed that it owned the epitope of binding to murine anti-hIgE mAb. CONCLUSION: The expression vector pET28a(+)-E34 has been successfully constructed and the target protein E34 recognized specifically by murine anti-hIgE mAb is obtained.     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

GST-人可溶性成纤维细胞生长因子受体1融合蛋白在酵母细胞中的表达及活性测定

目的：表达重组人可溶性成纤维细胞生长因子受体１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１，ｓＦＧＦＲ１），研究其对成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）生物学活性的拮抗作用。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＰＴ－ＰＣＲ）技术自人肺成纤维细胞获得ｓＦＧＦＲ１　ｃＤＮＡ，测序确证后，将其克隆人酵母细胞表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１；重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。利用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖抑制实验检测重组人 ｓＦＧＦＲ１的生物学活性。结果：经 ＣｕＳＯ４诱导，酵母细胞表达出重组谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为 １条约 ６０ｋＤ的阳性区带，在 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验中可被ＧＳＴ特异性抗体识别。重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白的粗提物在体外能够桔抗ＦＧＦ介导的促ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的活性。结论：重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白在酵母表达系统中得到有效表达，并具有很好的生物活性。     

人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析

TIL具有抗肿瘤的活性 ,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用。本实验拟扩增GrB全序列 ,构建GrB的原核表达载体 ,从而建立其原核表达体系 ,获得高效表达的重组GrB ,纯化蛋白。用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞 ,并抽提RNA ,RT PCR方法获得GrB的全长 ,并重组到pGEX 4T 1中 ,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定 ,IPTG诱导pGEX GrB转化的BL2 1菌 ,大量纯化表达产物 ,并通过SDS PAGE、Westernblot分析表达产物 ,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用。结果 :限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段 ,GrB准确克隆入pGEX 4T 1 ,成功的构建pGEX GrB ,经诱导表达出与GST融合的蛋白 ,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带 ,并能与GrB特异性抗体结合。体外实验表明 ,GrB能抑制Hep2细胞的增殖。成功构建了pGEX GrB ,并成功表达、大量纯化GrB蛋白 ,其能够抑制Hep2细胞的增殖。     

脂肪细胞新蛋白My027原核表达、纯化及生物活性研究

目的通过原核表达获得大量脂肪新蛋白质My027,并在体外初步研究其生物活性。方法RT-PCR法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,经亲和层析法获得融合蛋白,利用SDS-PAGE、Western印迹及质谱进行鉴定。在还原性谷胱甘肽存在的条件下,将纯化得到的融合蛋白作用于乙二醛酶Ⅰ的底物甲基乙二醛,通过分光光度法检测产物乳酸谷胱甘肽的生成。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠埃希菌BL-21胞浆中,纯化后的目的蛋白SDS-PAGE、Western印迹及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白质My027在pGEX-4T-2原核表达载体中可获高效表达,所纯化蛋白具有类似于乙二醛酶Ⅰ的作用。     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。