携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW。方法 XhoI线性化pLenti-EF1a-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI,接着BamHI酶切该片段,回收2722bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoRI线性化pFUGW,回收并补平EcoRI,然后BamHI酶切该片段,回收9174bp片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionI将其与连接用c-Myc-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUMGW。获pFUMGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒感染人胚肾细胞株293、肿瘤细胞株CNE1和C666以建立相应的病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUMGW,按标准程序生产的携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染293、CNE1和C666。结论成功构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW,为相关后续研究打下了良好基础。     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW。方法SacⅡ线性化pLenti-EF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平SacⅡ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.565kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUOGW。获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B以建立相应病毒感染体系。结果酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B。结论成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础。     

携带人Kif4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的:构建携带人Kruppel-like factor4(Kif4)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUKGW。方法:Xho I线性化pLenti-EF1a-Kif4-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI酶切位点,接着BamH I酶切该片段,回收2.842kb片段而获连接用Kif4-IRES-EGFP;EcoR I线性化pFUGW,回收并补平EcoR I酶切位点,然后BamH I酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒中的Solution I将其与连接用Kif4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUKGW。获pFUKGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;将携带Kif4和EGFP基因的慢病毒感染人肿瘤细胞株CNE1、C666和SW620以建立相应病毒感染体系。结果:酶切证实成功构建了pFUKGW,按标准程序生产的携带Kif4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染CNE1、C666和SW620。结论:本实验成功构建携带人Kif4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUKGW,为开展肿瘤细胞重编程研究打下了良好基础。     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的慢病毒表达载体pFUM3GW。方法NheⅠ和NotⅠ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302;BamHⅠ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物,并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionI将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序。所构建载体命名为pFUM3GW。获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系。结果PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F。结论成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础。     

构建携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体

目的为了研究宫颈癌的发病机制,构建携带人Sox2基因和EGFP基因的慢病毒表达载体。方法使用限制性内切酶Sac II酶切p Lenti-EF1a-Sox2-IRES-EGFP质粒,回收线性片段并补平Sac II切口,然后Xba I酶切该线性片段,回收3.432kb目的片段便获连接用Sox2-IRES-EGFP片段;Eco RI线性化p FUGW,然后用BKL试剂盒将酶切产物补平,然后继续用Xba I酶切已线性化的p FUGW(Eco R I酶切位点已补平),获得9.122kb和819bp片段,回收9.122kb目的片段以获得连接用载体片段。最后使用DNA连接试剂盒(Ta Ka Ra)中的Solution I将连接用Sox2一IRES-EGFP(3.432kb)和连接用载体片段(9.122kb)连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒行酶切鉴定。所构建新载体命名为p FUSGW。获p FUSGW载体后,按Invitrogen公司所推荐的标准程序进行慢病毒包装,然后确认慢病毒是否成功生产;使用携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和宫颈癌细胞株CC-2、CC-3以建立相应的病毒感染体系。结果经酶切鉴定证实成功构建p FUSGW,按标准程序生产的携带Sox2和EGFP基因的慢病毒上清可高效率感染宫颈癌细胞株CC-2、CC-3。结论成功构建了携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体p FUSGW,为宫颈癌发病机制的相关后续研究奠定良好的基础。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)shRNA的慢病毒载体,特异性下调中枢神经系统内VGLUT2的表达,从而为研究VGLUT1和VGLUT2的功能差异提供有力的工具。方法:首先在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA)序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经Age I和EcoRI双酶切)载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒。各组病毒载体转染原代培养的大鼠皮层神经元后,运用免疫荧光和Western Blot检测各组蛋白的表达水平。结果:pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效转染原代培养的皮层神经元,Western Blot检测结果显示:VGLUT2 shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比有显著性差异(P<0.05),分别为空白组的63.9±5.82%,73.8±3.18%;VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比同样有显著性差异(P<0.05),分别为空白组的39.1±1.99%,35.1±1.72%;VGLUT2shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组相比无显著性差异(P>0.05);但VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组与VGLUT2 shRNA-1和VGLUT2 shRNA-2病毒组相比有显著性差异(P<0.05)。表明VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4组病毒能较为高效的下调培养的皮层神经元VGLUT2的表达,下调效率超过60%。结论:本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步研究VGLUT2的功能及其与VGLUT1之间的功能差异提供了有力的工具。     

微小RNAmiR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNAhsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-26。前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体，双酶切后测序鉴定。筛选阳性克隆。用pIVTHM-miR-26a、psPAX2和pMD2-G3质粒共转染包装细胞293FT，包装产生慢病毒，以293FT细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经双酶切鉴定和测序证实，成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM—miR-26a。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光．并测得病毒滴度为5×10^5TU／ml。成功构建hsa—miR-26a的慢病毒表达载体，为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础．     

转录因子Sox2 SUMO修饰位点突变体的构建及真核表达

目的:构建Sox2及突变体Sox2 K247R的真核表达载体, 并在293FT细胞中表达.方法:以含有Sox2基因全长的馈赠质粒为模板, 用循环延伸PCR法得到该基因的突变体Sox2 K247R, 并将野生型及突变型基因定向亚克隆到真核表达载体pCMV-HA上.得到的重组质粒经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定.其后用脂质体包埋法将pCMV-HA-Sox2及pCMV-HA-Sox2 K247R分别单独转染或与pCMV-Myc-SUMO1共转染293FT细胞.采用Western blot分析蛋白表达情况及SUMO修饰情况.结果:经酶切和DNA序列测定, 重组子序列正确, 突变体第247位密码子由AAG转变为CGG.Western blot结果显示野生型及突变型的Sox2都在细胞内得到了很好的表达, SUMO修饰位点突变后, Sox2不能与SUMO蛋白结合.结论:Sox2野生型及突变型真核表达载体构建成功, 在蛋白水平体现了SUMO修饰的差异性.     

携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc和EGFP基因小鼠肿瘤细胞株的建立

目的构建稳定携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc（以下简称为OKSM）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的小鼠肿瘤细胞株。方法将载体pLentG-KOSM用NotI、XbaI线性化,并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,以鉴定其结构。按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带OKSM和EGFP基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hep1-6）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）和小鼠肺癌细胞（LLC）,以建立相应病毒感染体系。结果 pLentG-KOSM确实含有OKSM4种基因,按标准程序生产的携带OKSM和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染Hep1-6、4T1及LLC,成功建立稳定携带OKSM和EGFP基因的小鼠肿瘤细胞株。结论成功构建携带OKSM和EGFP基因的Hep1-6、4T1、LLC细胞株,为相关的后续研究打下了良好基础。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

pLXSN—EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C。为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98％的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30．7％细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化：使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。