STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（cholera toxin，CT）佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力，确定STAg和CT滴鼻免疫的最佳程序。方法BALB／c小鼠随机分为3组：1次、2次和3次免疫组，用20μgSTAg＋1μgCT／只分别滴鼻免疫1次，2次或3次，前2次间隔2周，末次间隔1周。末次免疫后第14天，用4×10^4个速殖子／只灌胃攻击所有小鼠，观察小鼠健康及死亡情况，攻击后第30天处死，ELISA法检测血清IgG和粪便IgA，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子，分离并计数派伊尔结（Peyer＇s patches，PP）和脾淋巴细胞数。结果2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组（P〈0．05），肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组（P〈0．001），血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组，PP和脾淋巴细胞数无显著性变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染。     

STAg联合ESA鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用

观察弓形虫可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen,STAg）与排泄-分泌抗原（Excreted/secreted antigens,ESA）单独或联合鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用。分别用PBS 20μL和STAg 20μg、ESA 20μg及联合抗原（STAg 10μg＋ESA 10μg）鼻内免疫BALB/c处女鼠2次,间隔2周。末次免疫后第13天处女鼠与雄鼠以2∶1同居。妊娠第8天用弓形虫速殖子（8000个/只）灌胃攻击所有孕鼠。妊娠第18天处死,计算活胎率,并测定孕鼠肝、胎盘和胎鼠脑组织弓形虫抗原和孕鼠脾组织内虫荷,同时测定孕鼠小肠冲洗液SIgA、血清IgG水平。结果表明,ESA组和联合抗原组活胎率显著高于PBS组,STAg组、ESA组和联合抗原组胎盘及胚胎感染率均低于PBS组,联合抗原组最低。孕鼠在弓形虫速殖子攻击后,PBS组明显出现竖毛、倦怠、腹部塌陷等异常表现,感染率为100%,死亡率为22.22%,而STAg组、ESA组和联合抗原组有轻微症状,感染率分别为85.71%、57.14%、57.14%,死亡率分别为16.67%、0%、0%。STAg组、ESA组和联合抗原组脾组织内虫荷均显著低于PBS组,减虫率分别为72.19%、72.29%、78.45%,ESA组和联合抗原组小肠冲洗液特异性SIgA均显著高于PBS组,联合抗原组最高,血清特异性IgG抗体水平差异不显著。由此可见,ESA单独或与STAg联合免疫可诱导孕鼠小肠液高水平SIgA,显著降低脾组织虫荷,显著提高胚胎存活率,表现出明显的垂直传播阻断的作用。     

不同佐剂的复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用

目的比较IFN-γ和蜂胶作为佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫攻击的能力,探索两种佐剂联合应用的效果。方法将5-6周龄雌性BALB／c小鼠60只随机分为4个组,每组15只,分别用20雌可溶性速殖子抗原（STAg）、20μg STAg＋40μg蜂胶、20μgSTAg＋1000U IFN-γ或20μgSTAg＋40μg蜂胶＋1000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次．间隔14d。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×10^4个／只灌胃攻击,逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43天处死全部存活小鼠,计算胸腺、脾指数,计数脑、肝组织速殖子。结果STAg＋IFN-γ组、STAg＋蜂胶＋IFN-γ组胸腺、脾指数显著高于STAg组（P〈0．05）;组织内速殖子虫荷显著降低（P〈0．01）,STAg＋IFN-γ组小鼠脑、肝组织减虫率分别为57．00％和79．06％;STAg＋蜂胶＋IFN-γ组小鼠脑、肝减虫率分别为68．30％和79．06％。STAg＋蜂胶组小鼠胸腺、脾指数有升高趋势,组织内速殖子虫荷降低,但与STAg组比较差异无统计学意义。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ、蜂胶＋IFN-γ的佐剂效果优于蜂胶,IFN-γ、蜂胶＋IFN-γ辅助STAg显著提高小鼠胸腺、脾比重,增强机体免疫能力,有效抵抗弓形虫的感染攻击,脑、肝组织速殖子虫荷显著减少。     

弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导体液免疫应答的动态观察

观察从Vero细胞与弓形虫速殖子共培养液分离的排泄-分泌抗原(Excreted-secreted antigens,ESA)鼻内免疫小鼠诱导的体液免疫应答及动态变化,为弓形虫复合黏膜疫苗候选抗原提供实验依据。BALB/c小鼠84只随机分为实验组和对照组,实验组以ESA为抗原(20μg/只),对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液20μL(μg/只),滴鼻免疫2次(间隔2周)。分别于2次免疫后第1、2、3、4、5、6、7周颈椎脱位处死小鼠。ELISA法测定血清IgG、IgA,粪便sIgA及肠液sIgA。结果表明,免疫组小鼠血清IgG、IgA和粪便sIgA及肠液sIgA均增高。血清IgG、IgA水平分别第5周、第4周达高峰,免疫后第1~7周(P<0.05)显著高于对照组。粪便sIgA第4周即达高峰,之后逐渐降低,至第7周仍(P<0.05)显著高于对照组。肠液sIgA第4周达高峰,第2、3、4周(P<0.05)高于对照组。可见,弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导体液免疫应答,特异性抗体生成明显且可持续较长时间。     

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用。     

不同毒力株弓形虫速殖子排泄分泌抗原（ESA）对小鼠自然杀伤细胞（NK）作用的比较

为观察不同毒力株弓形虫排泄分泌抗原（Excretory—Secretory antigen,ESA）对小鼠NK细胞的作用,将18只雌性C57BL／6J小鼠随机分为3组,各组每鼠分别腹腔注射刚地弓形虫RH株ESA200μL（含ESA0．002mg）,PRU株ESA200μL（含ESA0．002mg）和PBS200μL。于注射后6天取脾,流式细胞仪检测脾脏NK细胞的比例,并用乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）法检测各组NK细胞的杀伤活性,ELISA检测血清IFN-γ水平。结果显示,RH株ESA处理组NK细胞比例（5．974-0．26）％,PRU株ESA处理组NK细胞比例（3．32±0．29）％,两组均明显高于PBS对照组（3．084-0．39）％（P〈0．001）,其中RH株ESA处理组明显高于PRU株ESA处理组,差异有统计学意义（P〈0．001）;不同毒力株ESA处理的小鼠NK细胞杀伤能力较对照组有明显的升高,3组间差异有统计学意义（P〈0．01）;不同毒力株ESA处理后小鼠血清的IFN．1水平升高,与PBS组相比差异有统计学意义（P〈0．01）,其中RH组小鼠血清中IFN-1浓度较PRU组升高更为明显,差异存在统计学意义（P〈0．05）。结果表明,弓形虫ESA有活化小鼠NK细胞的作用,且RH株ESA的作用强于PRU株ESA。     

匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白免疫效果的动物实验评价

目的:探讨匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法:匹多莫德和毕赤酵母菌表达的弓形虫GRA1蛋白混合皮下注射免疫小鼠,以PBS作对照,检测其细胞免疫和体液免疫,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存情况。结果:匹多莫德能辅助GRA1蛋白刺激宿主产生较高的细胞免疫和体液免疫,并能提供较好的免疫保护力。GRA1蛋白加匹多莫德组、GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠IFNγ-、特异性IgG显著高于对照组(P<0.01)和GRA1蛋白组(P<0.01);各免疫组CD8+T细胞数量显著高于对照组(P<0.01);GRA1蛋白加匹多莫德组CD4+T细胞数量(P<0.01)、CD4+/CD8+比值显著高于其它免疫组(P<0.05)。各免疫组T细胞增殖活性与PBS对照组比较明显增强(P<0.01),GRA1蛋白加匹多莫德组T细胞增殖活性最明显。小鼠攻击试验表明,GRA1蛋白加匹多莫德组和GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠存活时间明显长于对照组和GRA1蛋白组。结论:匹多莫德与弗氏佐剂具有相似增强免疫应答和提高GRA1蛋白抗原的免疫原性作用,可望用于弓形虫亚单位疫苗的研制。     

以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗诱导的体液免疫应答及其免疫保护效应

目的：探讨以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护作用及其机制。方法:BALB/c小鼠随机分为9组：①空白对照组：PBS溶液；②壳聚糖酸溶液组；③壳聚糖颗粒组；④Hp抗原组；⑤Hp抗原+壳聚糖酸溶液组；⑥Hp抗原+壳聚糖颗粒组；⑦Hp抗原+CT组；⑧Hp抗原+壳聚糖酸溶液+CT组；⑨Hp抗原+壳聚糖颗粒+CT组，各组于第0、7、14、21 d 灌胃各免疫1次，免疫后4周给予1×1012CFU/L的SS1 Hp菌液每只 0.5 mL进行攻击，隔日1次，共2次。4周后，采用定量Hp培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内Hp感染。用ELISA法检测血清抗Hp IgG、IgG1、IgG2a及唾液和胃黏膜内抗Hp IgA，用SP免疫组织化学法检测胃黏膜内分泌型IgA（sIgA）。结果:①以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率达60%，与以CT为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率（58.33%）相似，显著高于单纯Hp抗原组及其它不含Hp抗原组（P<0.01或P<0.05），同时以CT＋壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的保护率为84.62%、85.71%，其Hp的定植评分显著低于无佐剂组及以CT为佐剂组（P<0.01，P<0.05）。②含佐剂的Hp疫苗所诱导产生的Hp IgG水平显著高于对照组及无佐剂组（P<0.01，P<0.05），而以CT＋壳聚糖为佐剂组所产生的抗Hp IgG水平显著高于仅以 CT或壳聚糖为佐剂组（P<0.05）。③胃黏膜内sIgA及特异性抗Hp IgA水平在壳聚糖为佐剂组与以CT为佐剂组无差别（P>0.05），显著高于无佐剂组，而壳聚糖与CT联合应用组显著高于单以CT为佐剂组（P<0.01，P<0.05）。结论:以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗对Hp感染具有免疫保护作用，并可成功诱导黏膜局部的特异性体液免疫应答，从而发挥免疫防御作用。     

弓形虫单克隆抗体的制备及其保护作用观察

应用杂交瘤技术制备弓形虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）。经克隆化获得２Ｂ１０、２Ｂ１１、２Ｇ８、２Ｄ１２；和１Ｄ１ＭｃＡｂ。用ＩＦＡ鉴定筛选，２Ｂ１０、２Ｂ１１为抗弓形虫整虫的ＭｃＡｂ、２Ｇ８、２Ｄ１２和１Ｄ１为抗弓形虫膜抗原的ＭｃＡｂ。用以上五株ＭｃＡｂ进行小鼠保护性试验：１．感染前２４小时、４８小时分别将５株ＭｃＡｂ稀释液注入小鼠腹腔，以１０４弓形虫速殖子进行攻击感染，结果２Ｂ１０、２Ｂ１１，和２Ｇ８对高毒株弓形虫感染鼠有明显的保护作用；２．将弓形虫速殖子与２Ｂ１０、２Ｂ１１和２Ｇ８孵育后再攻击感染能明显延长感染鼠的平均死亡时间（ＭＴＤ）；３．５株ＭｃＡｂ混合液于感染前２４小时注入小鼠体内及与速殖子孵育后也能明显延长感染鼠的ＭＴＤ。     

脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合基因诱导小鼠免疫应答研究

目的评价弓形虫SAG1与SAG3基因真核表达质粒DNA免疫小鼠的免疫应答效果。方法以PCR方法扩增出SAG1与SAG3目的基因片段,并插入载体pEGFP-N3以构建重组质粒pE- SAG1／SAG3,瞬时转染细胞Cos-7。质粒pESAG1／SAG3以10μg剂量,脂质体介导肌肉注射BALB／c小鼠,免疫3次,最后一次免疫后4周,观察体液和细胞免疫。RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录;斑点杂交方法检测目的基因是否与小鼠染色体基因组整合。结果质粒pESAG1／SAG3转染细胞后观察到绿色荧光;Western blot显示pESAG1/SAG3表达识别条带在相对分子质量(Mr)66．2×103附近。小鼠免疫后,血清产生抗弓形虫速殖子抗体,诱导IFN-γ及IL-2水平高于对照组。RT-PCR显示首次免疫15 d后,目的基因在肌肉组织中仍有转录,斑点杂交显示目的基因未与小鼠的基因组发生整合,混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合编码基因质粒接种小鼠能明显诱导体液和细胞免疫应答。     

（＋）-松萝酸治疗小鼠急性弓形虫病的初步研究

目的探索治疗弓形虫病的有效药物；初步观察（＋）-松萝酸治疗小鼠急性弓形虫病的疗效。方法小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子500个，建立急性弓形虫病动物模型；设立（＋）-松萝酸治疗组（50mg／kg，每日2次）、乙酰螺旋霉素治疗组（50mg／kg，每日2次）、DMSO及淀粉对照组（含1％DMSO的5％淀粉溶液0．5ml，每日2次），分别于感染2h后灌胃，每日2次，连续10d，观察对比疗效。结果50mg／kg（＋）-松萝酸治疗组明显延长了小鼠的存活时间，最长存活时间达15d，平均存活时间为10．63d；而螺旋霉素治疗组小鼠最长存活时间为10d，平均为7．37d；对照组仅5．42d。（＋）-松萝酸治疗组与螺旋霉素治疗组及对照组之间均有显著性差异。结论（＋）-松萝酸具有治疗急性弓形虫病的潜在作用，并且疗效优于螺旋霉素。     

免疫组织化学ABC法观察扁桃酸对小鼠急性弓形虫病肝脏病变的作用

目的用免疫组织化学ABC法观察扁桃酸治疗小鼠急性弓形虫病肝脏的病变，探讨扁桃酸对病变肝脏的保护作用。方法扁桃酸200mg／kg，2次／d，口服和静脉注射治疗弓形虫感染小鼠，同时设立乙胺嘧啶及扁桃酸药物对照组，治疗不同时间后取肝脏组织，常规制作病理切片，免疫组织化学ABC法常规染色。结果阳性对照组可见大量肝细胞坏死区，其内可见形态典型的弓形虫速殖子，扁桃酸治疗组仅见少量散在的黄染肝细胞，乙胺嘧啶对照组小鼠肝组织内也仅见少量散在的黄染肝细胞，但肝细胞受到明显的毒性损害。因而扁桃酸能有效地抑制弓形虫速殖子入侵肝细胞，减轻弓形虫速殖子对肝细胞的破坏程度，且扁桃酸对肝细胞的毒副作用极少。结论扁桃酸对弓形虫感染小鼠的肝脏有明显的保护作用。     

日本血吸虫TCTP编码基因DNA免疫的效果评价

目的评价pEGFP—TCTP真核重组质粒联合免疫佐剂CpG诱导小鼠保护性免疫的效果。方法构建日本血吸虫TCTP真核重组质粒．将pEGFP—Tc口注射入BABL／c小鼠，采用ELISA法检测免疫小鼠血清中IFN-γ水平；尾蚴攻击感染后45d处死小鼠，收集成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；小鼠肝脏送病理切片，计算虫卵肉芽肿的数量。结果TCTP DNA免疫保护性效果显示：实验组与阴性对照组相比，显示出一定的保护性效果．TCTP组的减虫率和减卵率分别为43．91％和53．48％．与GST组效果相似。DNA免疫后及感染后期，TCTP组与PBS对照组血清IFN-γ水平有显著性差异（P〈0．05）；攻击感染前后组间比较发现，GST组和GST＋CpG组有显著性差异（P〈0．05），提示CpG显著提高了DNA免疫的效果。结论SjTCTP DNA免疫能诱导较明显的保护性Thl免疫应答。CpG基序可以有效的诱导保护性Th1免疫应答，是一种有效的DNA免疫佐剂。     

Regulation of immunoglobulin E production in mice immunized with an extract of Toxoplasma gondii.

Repeated infection with Toxoplasma gondii could not induce immunoglobulin E (IgE) antibody production. When mice were injected intraperitoneally twice over a 3-week interval with an extract of tachyzoites of T. gondii and Al(OH)3 as adjuvant, antitoxoplasma IgE antibody was produced. Antitoxoplasma IgE antibody titers were low and diminished after a short time in B10.S, BALB/c, C3H, and C57BL/6 mice. This tendency was more evident in IgE low-responder SJL mice. IgE-inducing activity of Toxoplasma antigen was weaker than those of keyhole limpet hemocyanin, ovalbumin, and an extract from Nippostrongylus brasiliensis. The antitoxoplasma IgE antibody production was enhanced by and persisted after whole-body irradiation (150 R) following secondary immunization. The enhanced antitoxoplasma IgE antibody production was suppressed by transferring spleen cells from Toxoplasma antigen-immunized mice. The suppressive effect of the spleen cells was Toxoplasma antigen specific and was removed by treatment with anti-Thy-1.2 and complement. These results indicate that the low IgE production induced by Toxoplasma antigen is the result of irradiation-sensitive and antigen-specific suppressor T cells. These findings might explain the lack of IgE antibody response in mice with Toxoplasma infection.