Survivin反义寡核苷酸诱导人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的实验研究

目的Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，在多数恶性肿瘤组织中丰富表达。因此，观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）转染对人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡、增殖、细胞对化疗药物敏感性的影响。方法设计合成针对Survivn mRNA特异性的ASODN，透射电镜观察细胞形态变化，流式细胞术检测各组细胞增殖指数（proliferative index，PI）和碉亡指数（apoptotic index，AI），RT-PCR法分析转染后Sur-vivn mRNA及Caspase-3 mRNA的变化，Western Blot法检测各组Survivn蛋白表达情况，荧光分光光度法测定Caspase-3的活性水平；MTT实验测定T24细胞对丝裂霉素（mitomycin，MMC）的敏感性。结果A—SODN转染组透射电镜下观察到凋亡的征象，而各对照组未见凋亡证据；各转染组细胞AI明显高于各对照组，PI明显低于各对照组（P〈0．01），且在一定范围内呈量一效关系，各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；各转染组细胞Survivin mRNA、Survivin的表达较各对照组明显下调（P〈0．01），各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；Caspase-3 mRNA的表达在各组细胞间差异无显著性（P〉0．05）；各转染组细胞Caspase-3活化水平较各对照组明显提高（P〈0．01），各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；MTT实验显示，转染组MMC半数抑制浓度（IC50）较对照组明显下降，ASODN可提高T24细胞对MMC的敏感性。结论Survivin ASODN转染L细胞后可特异性封闭Survivin的表达，对Caspase-3 mRNA的表达无明显作用，能激活Caspase-3无活性前体，从而诱导T24细胞凋亡，抑制细胞增殖，提高T24细胞对化疗药物MMC的敏感性。     

藏花素促膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的研究

目的研究藏花素诱导膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的作用及分子机制。方法通过MTT比色法分析藏花素对T24细胞增殖的影响;应用光镜观察细胞形态学的改变;Annexin V-FITC／PI荧光双标流式细胞术检测T24细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响,RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达变化。结果藏花素能明显抑制T24细胞的增殖,并可导致其形态学的改变;随藏花素作用时间的延长,G0／G1期细胞比例逐渐增加,S期和G2／M期细胞比例逐渐减少,早期凋亡细胞逐渐增多,同时可以上调Bax和下调Bcl-2的基因表达水平。结论藏花素可明显抑制T24细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,可能与Bcl-2和Bax等凋亡调控基因有关。     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

体内转染eNOS基因抑制损伤后动脉内膜新生的实验研究

目的 研究体内转染eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因对损伤后血管内膜新生的抑制作用.方法 2F球囊导管损伤大鼠颈总动脉内膜后,随机分成空白对照组、pcDNA3、1(-)组和pcDNA3.1-eNOS组,分别以PBS、脂质体Fugene 6介导pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1-eNOS体内转染至损伤后血管段,2周后对转染后血管平滑肌细胞行RT-PCR鉴定eNOS基因mRNA表达;转染1个月和2个月后对各组颈总动脉行免疫组化染色,计算机图像分析计算新生内膜面积(1)、新生内膜/中膜面积比值(I/M).结果 pcDNA3.1-eNOS体内转染组的颈总动脉血管平滑肌细胞有效表达eNOS基因mRNA.转染后1个月和2个月,eNOS基因体内转染组血管新生内膜面积、I/M比值均比PBS对照组、空载体pcDNA3.1(-)转染组显著减少(0.01).结论 eNOS基因体内转染损伤后动脉能有效抑制血管内膜新生,防止损伤后血管再狭窄.     

肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的 探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响.方法 以肝癌特异性T细胞受体V β7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达.肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群:以Annexin V-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能.结果 TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.与PBMC对照组相比.TCRVβ37.1转染组CD45RO表达显著上升.以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞.分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升.结论 肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化.TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能.     

姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

目的 本研究旨在探讨姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖的影响。方法 培养人膀胱癌T24细胞,施加不同浓度姜黄素（10,50,100,250,500μM）,观察对细胞增殖的影响。应用四唑盐比色法（MTT法）观察细胞增殖抑制情况;应用彩色图像分析系统观察细胞形态学特征（HE染色）。结果 姜黄素各组较对照组增殖降低;姜黄素各组,存在剂量一效应关系（10～500μM）和时间-效应关系（12h,24h,48h,72h）。结论 姜黄素抑制人膀胱癌124细胞增殖。     

Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对膀胱移行细胞癌T24细胞生长、增殖的影响

目的 探讨Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ对Src蛋白及其下游信号作用。方法 采用半定量RT—PCR法检测Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理后的人膀胱癌细胞T24各浓度组（0、0．2、1．0、5．0μmol／mL组）的c—Src、p38MAPK基因表达的变化情况,使用Western blot检测Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理后T24细胞内的c—Src蛋白磷酸化类型与非磷酸化类型的表达情况。结果 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ处理有下调后的人膀胱癌细胞T24各浓度组的c—SrcmRNA的表达下调;p38基因的表达呈逐渐下调趋势。处理后T24细胞内c—Src基因在蛋白表达水平上其磷酸化类型随Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ浓度的增高表达逐渐下降,并且呈剂量效应关系。结论 Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ可能通过竞争Src蛋白磷酸化位点,使其不能激活,导致下游的细胞传导途径失活使得T24细胞增殖得到抑制,认为Src蛋白具有作为膀胱移行细胞癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性。Src酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ可能可以通过阻止Src蛋白激活影响其下游的Ras／Raf／MEK／MAPK（ERK1／2或p38）通路和ERK1／2和p38细胞信号传导通路,下调p38表达不仅直接和间接地诱导T24细胞凋亡,而且可以阻止或减少T24细胞的迁移、扩散和穿膜侵袭的发生。     

HepaCAM基因对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用研究

目的:研究hepaCAM基因对人膀胱癌T24细胞增殖的影响.方法:运用脂质体转染方法,将pEGFP-N2-hepaCAM质粒转入T24细胞株,经G418筛选获得稳定表达的细胞株;RT-PCR及Western blot方法检测目的基因和蛋白表达;MTT法及克隆形成实验研究hepaCAM基因对T24细胞体外生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR技术测定周期调控蛋白CyclinD1的mRNA表达变化.结果:RT-PCR和Western blot方法分别检测到hepaCAM的基因表达和蛋白表达,MTT检测转染hepaCAM基因的细胞生长速度较对照组和空载体组明显减慢(P<0.01),克隆形成率明显小于对照组和空载体组(P<0.01).细胞周期中G0/G1期比例明显增高(P<0.05),而S期比例减少;CyclinD1 mRNA表达明显下调(P<0.05).结论:HepaCAM基因通过阻滞细胞于G0/G1期,减少CyclinD1 mRNA表达,抑制T24细胞的增殖.     

CD105在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 研究CD105在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及意义.方法 用免疫组化方法检测40例BTCC组织和12例正常膀胱黏膜组织中CD105的表达;在200倍视野下于"热点"处计数抗-CD105单抗标染的微血管密度(MVD),比较其与BTCC的临床病理特征间的关系.结果 在BTCC组织中CD105阳性表达率为72.5%,明显高于对照组(16,7%)P＜0.01;在BTCC组织中,以抗-CD105标染的微血管密度CD105-MVD(73.59±10.67)明显高于对照组(20.50±3.54),P＜0.01;CD105-MVD随BTCC分级分期升高而增加,肿瘤复发者高于无复发者,肿瘤转移者高于无转移者,P＜0.01.结论 CD105在BTCC中高表达,抗-CD105标染的MVD与BTCC分级分期、转移及复发密切相关.     

T细胞表达CD137L分子介导对血管内皮细胞的活化刺激效应

目的探讨活化T细胞表面表达的CD137L分子对内皮细胞功能的影响.方法将活化的T细胞与内皮细胞共培养,ELISA检测共培养上清中IL-1、IL-8的含量;流式细胞仪检测内皮细胞表面粘附分子ICAM-1的表达变化,并观察用融合蛋白CD137-Fc阻断CD137-CD137L共刺激通路后内皮细胞分泌细胞因子的变化.结果活化的T细胞刺激了内皮细胞活化,诱导了内皮细胞合成和分泌细胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表达;可溶性融合蛋白CD137-Fc成功地阻断了CD137-CD137L的相互作用,内皮细胞合成和分泌细胞因子的能力降低.结论证明CD137-CD137L的相互作用在内皮细胞与T细胞的相互作用中发挥了重要的作用,提示CD137与其配体交联具有刺激内皮细胞活化的生物学功能.     

缺氧再氧合过程中CD147基因在卵巢癌细胞系中的表达

目的:探讨缺氧再氧合过程中CD147基因在卵巢癌细胞系中的表达.方法:卵巢癌细胞系3-AO,HO-8910PM分别在混合气体缺氧仓中缺氧30 min后更换新鲜培养液,给予再氧合,常氧下继续培养0,4,8 h.激光共聚焦显微镜定位,定量检测CD147的表达.结果:CD147定位于细胞质.急性缺氧30 min后两种卵巢癌细胞系中CD147表达量明显高于对照组,再氧合4,8 h时CD147的表达量明显降低.两种细胞株均表现为再氧合4 h时CD147的表达与对照相比无明显差异(P>0.05),再氧合8 h时降为最低.结论:缺氧上调卵巢癌细胞系中CD147的表达,再氧合可使高表达回降.     

PLCε siRNA转染对膀胱癌细胞株T24侵袭能力的影响

目的:研究磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)siRNA表达质粒的转染对人膀胱癌细胞系T24侵袭转移能力的影响.方法:分别将携有PLCε siRNA基因的真核表达质粒两对p11-PLCε和p12-PLCε载体体外转染T24细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PLCε mRNA的表达情况,应用Transwell小室侵袭试验、明胶酶谱分析分别研究转染前、后膀胱癌细胞侵袭转移能力的变化,并以空载质粒HK-A转染和未转染细胞为对照.结果:RT-PCR检测显示p11-PLCε,p12-PLCε转染成功后T24细胞PLCεmRNA表达明显比空质粒HK-A转染和未转染细胞减弱;p12-PLCε siRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(26.8±5.8)和p11-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(25.8±6.2)明显少于未转染细胞(34.8±6.9)和HK-A转染细胞(33.8±5.7)(P＜0.01);明胶酶谱分析显示转染P11-PLCε、p12-PLCε均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于未转染细胞和HK-A转染细胞.结论:推测转染外源性PLCεsiRNA基因能下调PLCε基因的表达并能抑制膀胱癌细胞侵袭转移.     

膀胱移行细胞癌CD44蛋白表达及临床意义

目的 探讨CD44蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学技术检测55例膀胱移行细胞癌CD44蛋白的表达。结果 55例膀胱移行细胞癌中，CD44蛋白表达阳性率为56.4%，在膀胱移行细胞癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中分别为37.5%、60%、68.4%。CD44表达分别与膀胱移行细胞癌病理分级和肿瘤大小无显著性差异（P＞0.05)，与膀胱移行细胞癌转移有显著差异（P＜0.05)。结论 对CD44蛋白检测可以作为预测肿瘤转移的辅助指标。     

BIRC5基因沉默对人膀胱癌细胞系T24增殖抑制的研究

目的 探讨靶向抑制膀胱癌细胞系T24中BIRC5基因的表达后,该基因编码产物Survivin蛋白对膀胱癌增殖的影响.方法 将设计合成的靶向BIRC5序列的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染膀胱癌细胞系T24,应用RT-PCR技术和Western blot方法检测目的基因转录及表达水平.通过生长曲线来检测survivin基因沉默后细胞增殖的改变.结果 特异性siRNA转染后,survivin mRNA及蛋白水平均明显下降.与空白对照组相比较,转染组细胞增殖情况明显受到抑制,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 特异靶向survivin的siRNA能有效抑制survivin的表达,显著抑制细胞的增殖,为膀胱癌的临床治疗提供新方向.     

CD24蛋白在膀胱癌中的表达及意义

目的探讨CD24蛋白在膀胱癌中的表达及其与膀胱癌临床特征的关系。方法采用免疫组化方法对43例膀胱肿瘤、10例正常膀胱组织中CD24的表达进行检测。结果CD24蛋白主要表达于膀胱恶性肿瘤细胞的细胞膜和胞浆中,其阳性例数为27例,阳性率为62．8％,在正常膀胱组织中1例阳性表达,阳性率10％。在43例膀胱肿瘤石蜡标本中,CD24表达强度与肿瘤分级和分期有关,恶性程度高的肿瘤阳性表达高于恶性程度低的肿瘤,浸润性癌也高于非浸润性癌（P〈0．05）。结论①CD24在膀胱癌中的表达明显高于在正常膀胱组织中的表达。②CD24高表达与膀胱移行细胞癌的分化和浸润性进展密切相关。③CD24高表达可能成为判断膀胱移行细胞癌预后的一个重要指标。