无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。 目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。 方法：应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。 结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程      

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。 目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。 方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1× 10⁶/cm²的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。 结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

新生大鼠视网膜神经干细胞的分离培养与诱导分化

目的 初步探讨新生大鼠视网膜神经干细胞的诱导分化。方法 从新生大鼠视网膜分离具有自我更新能力的细胞克隆，传代。用脑源性神经营养因子(BDNF)与血清单独或联合培养诱导其分化，采用免疫细胞化学及免疫荧光化学技术对分化前后的细胞进行鉴定。结果 分离获得的细胞具有连续克隆的能力，表达nestin。分化后细胞分别表达多种神经元及神经胶质细胞的特异性标志物；BDNF与血清联合作用可使细胞向神经元分化的比例提高。结论 新生大鼠视网膜内存在具有自我更新与多分化潜能特性的神经干细胞，BDNF作为辅助诱导剂，可促进其存活、分化、成熟，并可能诱导其向神经元方向分化。     

大鼠胚胎视网膜祖细胞分离培养及其分化特性

目的：建立大鼠胚胎视网膜祖细胞体外培养方法并观察其分化特性。方法：取孕18d大鼠胚胎,用无血清培养技术扩增视网膜祖细胞;用免疫细胞化学、扫描电镜与透射电镜技术对祖细胞的特性及诱导分化的细胞类型进行鉴定。结果：从胚胎大鼠视网膜神经部分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞球能表达Nestin并具有掺入BrdU的能力。诱导分化后的细胞表达,其中,Thy1．1^ 细胞最多,Opsin^ 细胞次之,GS^ 细胞较少,PKC^ 细胞少,Syntaxin^ 及Peripherin^ 细胞极少,不表达Calbindin D-28K。结论：从胚胎大鼠分离的细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能,属于视网膜祖细胞;诱导分化产生5种视网膜细胞,以节细胞最多,未见水平细胞。     

新生大鼠心祖细胞原代分离培养及鉴定

目的原代分离培养及鉴定新生大鼠心祖细胞(CPCs)。方法利用差速贴壁原代分离培养CPCs,形态观察和二乙酸羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)示踪法检测细胞增殖。使用Fluo-3/AM钙离子检测法,检测集落增殖细胞中钙离子浓度变化。免疫荧光技术检测集落增殖细胞的干细胞标记物及心肌细胞标记物的表达。结果差速贴壁法获得细胞培养1周左右即观察到集落增殖的细胞,圆/椭圆形或不规则多边形细胞呈铺路石样排列。随培养时间延长,细胞集落增大。培养3周左右,细胞集落中细胞形态发生改变(分化),逐渐出现突起或呈梭形等,集落中出现波动/跳动的心肌细胞。用CFDA SE示踪显示,细胞呈集落增殖特点;Fluo-3/AM钙离子检测显示,集落增殖细胞中分化细胞的钙离子浓度增高。免疫荧光检测显示,不同的集落增殖细胞具异质性,存在c-kit~+/CD34~-、Nanog~+/CD34~-和c-kit~-/Nanog~-细胞集落;增殖的细胞集落存在c-kit和Gata4阳性共表达,随细胞分化出现心肌肌钙蛋白T(c Tn T)细胞集落。结论差速贴壁法原代分离培养的心祖细胞具有集落增殖和分化为心肌细胞的能力,是研究心祖细胞表面标记物、增殖和调控机制的理想材料。     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。 目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。 方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CD133、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进一步鉴定培养细胞。 结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CD133、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac-LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

兔外周血内皮祖细胞的分离培养、鉴定和体外标记

目的 研究新西兰大白兔外周血内皮祖细胞的分离、培养方法,对其进行功能鉴定,同时用增强型绿色荧光蛋白对细胞进行标记示踪,为后续实验研究做好准备.方法 ①以健康雄性新西兰大白兔为研究对象,密度梯度法分离兔外周血单个核细胞,采用专用的EGM-2 MV完全培养基对单个核细胞进行诱导分化培养,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板,动态观察细胞生长过程.②通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素UEA-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合UEA-1的细胞,双染色为橙色荧光.③用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒液对培养7 d细胞进行感染,用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况.结果 细胞形态观察：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,第3～4天可观察到贴壁梭型细胞,第5～8天出现多个细胞团.乙酰化低密度脂蛋白和凝集素UEA-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果：在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上,与凝集素UEA-1结合率几乎达100%,2者双染色率达90%以上;腺病毒感染细胞后24 h即可表达EGFP,5 d表达最强,1～2周表达稳定,此后逐渐减弱;腺病毒感染MSCs效率约为95%.结论 从兔外周血中能成功地分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体;经Ad-EGFP感染后的EPCs可有效表达EGFP,且转染效率较高,是一种较好的EPCs标记方法.     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。 目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。 方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。 结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

视网膜祖细胞干细胞特性及移植入视网膜后的研究

目的：研究视网膜祖细胞的干细胞特性及移植入视网膜后的存活和迁移。方法：体外培养胎龄18d 大鼠的视网膜细胞,用 RT-PCR、细胞免疫荧光方法鉴定其增殖分化;成年 SD 大鼠腹腔注射 N-甲基-N-亚硝基脲形成视网膜感光细胞退化的动物模型,培养的视网膜祖细胞用 CM-Di(?) 标记后,移植入模型鼠的玻璃体腔。结果：视网膜祖细胞体外表达中间神经丝蛋白 nestin;表达 Flk-1、Pax6及 Notchl 的 mRNA;能掺入 BrdU;分化后表达视网膜各类细胞特异性蛋白;移植后在实验组大鼠视网膜能存活及迁移,而在对照组中仅聚集在玻璃体腔。结论：视网膜祖细胞具有干细胞特性,移植入受损伤视网膜后,能存活、整合及迁移。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的 研究大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的分离、鉴定、培养方法以及向内皮细胞分化的诱导条件.方法 密度梯度离心法分离SD大鼠股骨及胫骨单个核细胞,经差速贴壁后取2次贴壁细胞置于纤连蛋白铺被的培养板中.在血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)诱导下培养两周,观察其形态学改变,以免疫细胞化学染色及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法对其进行鉴定.结果 贴壁细胞呈现铺路石、团簇样生长,呈梭形、线样排列特殊形态.免疫细胞化学结果显示,贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、血管性假血友病因子(vWF)在不同时段呈阳性表达.诱导培养第2天,CD133阳性表达率为(79.4±4.5)%.自诱导培养的第6天开始,Flk-1与vWF呈高表达,阳性率为(74.2±3.5)%和(72.2±4.3)%.结论 用Percoll密度梯度离心法在VEGF、bFGF及EGF培养体系下可以获得较高纯度的EPC,该细胞具有内皮细胞的特性,经过体外诱导可以分化为内皮细胞.     

大鼠外周血内皮祖细胞体外分离鉴定及内皮细胞的分化

目的：建立一种稳定的体外分离培养及诱导分化大鼠外周血内皮祖细胞(EPC)的方法。方法：抽取SD大鼠外周血，应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞，同时应用VEGF和bFGF诱导，使之向内皮细胞分化，以免疫细胞化学鉴定贴壁细胞的内皮标志CD31，CD34，Flk-1和vWF。结果：经VEGF和bFGF诱导后的EPC的内皮标志CD31，CD34，Flk-1和vWF在不同时段呈阳性表达。结论：大鼠外周血中含有EPC，在体外特殊诱导环境下，可定向分化为内皮样细胞，     

小鼠肝细胞分离技术及无血清培养方法的介绍

本工作改良了小鼠肝细胞的分离技术，并建立了小鼠肝细胞的无血清培养方法，采用二步原位灌流分离的小鼠肝细胞，其活率及产量分别为８６．９±１．０％和２．３±０．３×１０＾７，能够满足实验的要求，肝细胞在无血清培养条件下，２４小时可完全贴壁，在继续培养的２４－４８小时期间，属入培养中的ＧＰＴ和ＧＯＴ可稳定于低水平，贴壁细胞数量（以贴壁细胞ＤＮＡ含量为指标）与培养前的活细胞数基本相同并保持稳定，肝细胞形态正     

人脐带内皮祖细胞的分离、鉴定及转染EGFP质粒的实验研究

目的 从脐带中分离内皮祖细胞(EPCs),考察其体外增殖、基因转染绿色荧光蛋白质粒的行为.方法 以酶消化法从脐带中分离出内皮祖细胞,并通过流式细胞仪和共聚焦显微镜对内皮祖细胞进行鉴定,以Lipofectamine 2000为转染试剂考察了内皮祖细胞转染绿色荧光蛋白质粒的行为.结果 从脐带中分离培养的内皮祖细胞在第9天形成了典型的内皮细胞集落,流式细胞仪分析结果显示CD133和激酶插入区受体(KDR)的含量均有所提高,并具有内皮祖细胞结合异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荆豆凝聚素1(FITC-UEA-1)和吞噬DiI标记的低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)的功能,能较好地表达绿色荧光蛋白.结论 从脐带中分离的内皮祖细胞体外在适当的培养条件下,可增殖、诱导分化为内皮细胞,并能较好地表达外源基因,是基因与细胞治疗理想的载体.     

大鼠骨髓胚胎样干细胞的培养和鉴定

目的:探索骨髓胚胎样干细胞(ELSCs)的分离纯化和鉴定方法,并探讨该细胞分离培养方法的可行性。方法:采用全骨髓培养、明胶包被和无血清培养的方法,培养SD大鼠骨髓细胞,5 d后进行第1次传代,以后每2 d传代1次。观察其形态结构;免疫荧光检测其表面标志物CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测干性标志物SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog的表达,并与骨髓间充质干细胞(MSCs)相比较;检测其向成骨细胞和成脂细胞的诱导分化能力。结果:获得的ELSC呈现长梭形,体积小且形态均一。免疫荧光示其表达CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测示ELSCs表达CD73、CD90、CD105,且纯度高于95%,与MSCs相比,ELSCs的SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog等干性基因表达较高。结论:该方法获得的ELSCs干性较强、强度较高,可分离、培养出ELSCs。     

兔外周血两种内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的研究新西兰大白兔外周血两种内皮祖细胞(EPC和EOC)的分离培养和鉴定。方法由兔耳中央动脉采集外周血,以密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),置于EGM-2培养基中培养。用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)摄取试验和FITC标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合试验,检测flk-1表达的免疫荧光法和检测CD34、Ⅷ因子表达的免疫组化染色法,以及体外血管形成试验对EPC/EOC进行鉴定。结果从新西兰大白兔外周血MNC中可成功地培养出EPC和EOC。培养第7天的EPC和第16天的EOC均能吞噬ac-LDL并与凝集素UEA-1相结合,同时均可表达CD34、flk-1和Ⅷ因子相关抗原。EOC在matrigel凝胶上可形成血管腔样的结构。结论用密度梯度离心法从兔外周血中分离的MNC在一定的培养条件下,能分化成为EPC和EOC,为后续的实验研究提供了细胞来源。     

骨髓CD34+造血干/祖细胞的分离、纯化及鉴定

造血干细胞(HSC)工程是利用HSC的生物学特征．通过细胞工程的技术,在体外模拟或部分模拟体内的造血过程,对分离纯化的造血干/祖细胞(HSC/HPC)进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等,最终将造血细胞治疗更广泛有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治     

成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化

目前多以施万细胞(Schwann cell,SC)、神经干细胞(neural stem cell,NSC)、骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)为种子细胞构建组织工程化周围神经。然而SC传代后形态和功能逐渐改变,NSC来源受限,BMSCs向神经细胞的分化率相对较低,因此寻     

人胚脑皮层神经干细胞的分离培养及鉴定

目的 从人胚脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞，方法 利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代、分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白（Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 从胚龄10周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原，分化后的细胞表达神经元细胞，胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 人胚脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

人脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离培养,为内皮祖细胞的临床应用提供实验方法。方法选择脐静脉血,应用密度梯度离心法,获取单个核细胞,接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF的内皮细胞专用培养基EGM-2MV培养细胞,3d后,洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d,收集贴壁细胞进行细胞分析。激光共聚焦显微镜进行细胞功能学鉴定,流式细胞术测定祖细胞和内皮细胞系标志。MTT比色法检测细胞的生长状态。结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,祖细胞标志CD133及内皮细胞特异性抗原CD34、KDR检测,其阳性率分别为（27．05±2．94）％、（16．37±2．69）％和（56．67±7．29）％;体外培养的内皮祖细胞具有良好的细胞增殖活性。结论人脐静脉血中可以分离培养内皮祖细胞,为内皮祖细胞的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化

背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点,通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得,但是存在着操作繁琐,花费高等不足。 目的：观察组织块培养法分离的脂肪源性干细胞的基本生物学特性及其向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞的诱导分化潜能。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧腹股沟脂肪组织,组织块法分离培养脂肪源性干细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析干细胞表面标志表达。取第4代脂肪源性干细胞用成骨诱导液、成脂诱导液、内皮祖细胞诱导液培养两三周并进行鉴定。 结果与结论：组织块培养法得到的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞生长为主,呈漩涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈抛物线形;细胞表面标志CD44、CD90、CD29呈阳性表达,CD45、CD31呈阴性表达。成脂诱导后细胞油红O染色阳性、成骨诱导后细胞茜素红染色阳性。诱导后的内皮祖细胞CD34及DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性。以上结果显示组织块培养法能成功分离培养出脂肪源性干细胞,且获得的细胞纯度较高、易于增殖培养,能高表达干细胞表面抗原以及具有向骨细胞、脂肪细胞及内皮祖细胞多向分化的潜能,可以满足组织工程研究种子细胞的需求。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程