抗人卵巢癌单克抗隆体的研制

用病理证实为卵巢浆液性囊性腺癌病人腹水在体外传代培养生长的细胞(第15代左右)免疫BALB/c小鼠.取其脾脏与骨髓瘤NS-1细胞融合,用间接免疫荧光法筛选抗卵巢癌细胞阳性克隆,经多次克隆化培养,得到五株杂交瘤细胞:G_4,H_1-B_7,H_1-B_8,E_(10)和     

大鼠混合胸腺细胞培养上清替代饲养细胞的初步研究

饲养细胞被广泛运用于杂交瘤技术中,但由于每次需预先制备,增加了污染的机会,使用起来也不方便,本实验采用同窝乳大鼠胸腺制备胸腺细胞培养上清(MTM),并在细胞融合、有限稀释中应用,结果发现用MTM     

影响杂交瘤细胞融合成功率的若干因素的探讨

1980年以来,我国各地虽有大量关于杂交瘤技术以及建立单克隆抗体杂交瘤细胞株的报 告,但关于影响细胞融合成功率的报道为数不多,我们为了提高细胞融合率特进行PEG浓度、pH,用量以及提高用于融合的骨髓瘤细胞活性的方法和应用饲养细胞(Feeder cells)     

杂交的杂交瘤(Hybrid hybridoma及其在免疫组化中的应用

作者采用杂交瘤技术,制备了大鼠的抗生长抑制素—抗过氧化物酶的双重特异性克隆抗体(Bispecifi c Monoclonal Antibodies),并将它应用于检查大鼠垂体生长抑制素的免疫组化中,证明它比化学法重建的双特异抗体好。取Lou大鼠1/3瘤细胞与辣根过氧物酶免疫的Wistar大鼠脾细胞融合,获得杂交瘤克隆YC6/41。使它对氮杂鸟嘌呤(8 AG)抵抗,对HAT敏感。反复克隆     

藻酸钙凝胶固定法能增进无血清培养基中杂交瘤产生抗体的稳定性

虽然在杂交瘤细胞培养中加入胎牛血清能促进细胞生长,但胎牛血清价格昂贵。其组分尚未完全弄清,再加之其质量不稳定,它还常常是微生物污染的来源,血清带入到培养液中的蛋白质,使得抗体的纯化困难。这些都是使用胎牛血清的不利因素。人们进行了大量的研究以期减少或停止使用血清。现已有好几种无血清的杂交瘤细胞培养基应市。然而,研究发现,杂交瘤细胞在无血清培养基中长期培养会丧     

抗人红细胞单克隆抗体的制备和鉴定

按常规方法将O型人红细胞免疫的BaLb/C小鼠脾细胞和NS-1骨髓瘤细胞融合。两次克隆后,获得两株分泌抗人红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,H_4D_1和H_4E_(10)。细胞培养上清液经透析浓缩2～5倍,同小鼠Ig分型血清作免疫双扩散试验。结果     

不同培养基对人杂交瘤细胞培养效应的影响

培养液是细胞培养的基本要素,选择适当的培养液是人杂交瘤技术成功的重要因素之一。我们分析比较了三种商品化培养液RPMI1640、DMEM、IMDM对分泌人单抗杂交瘤细胞的培养效应,包括对维持细胞的活力、增殖、克隆效率及抗体分泌等参数的观察比较,发现RPMI1640对人-(人×鼠)杂交瘤细胞“87-3”与人-鼠杂交瘤“87-3”培养效应最佳,为首选培养液。     

用电融合法和PEG融合法制备人细胞毒T细胞杂交瘤

目前,人细胞毒T淋巴细胞克隆的体外长期培养,已在一些实验室建立。但是,这些克隆的生长有限,且需要饲养细胞、IT-2和一些未知的生长因子。为克服这些限制,作者进行了制备人细胞毒T细胞杂交瘤的探索细胞系已报道的有细胞溶解活性的杂交瘤细胞系只有鼠-鼠和人-鼠系统,建立人-人T细胞杂交瘤,存在着在融合过程中或融合程序后细胞毒T细胞对瘤细胞或杂交瘤细胞的非特异溶解、融合细胞始动生长太慢(常需一个月以上才能观察)、杂交瘤细胞的杂色体不稳定等困难。作者通过使用修改的PEG法和电融合法来克服这些困难,以求建立有稳定的细胞毒功能的人T细胞杂交瘤。     

用杂交瘤技术生产小鸡单克隆抗体的一种新细胞系

从小鸡获取的免疫球蛋白G(IgG)具有一定的共同特性,有利于免疫化学研究和临床应用,但由于生产这种单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系尚未建立,因此未能广泛应用。作者曾试图建立适合于生产McAb的小鸡B细胞系。但以往所选B细胞融合的杂交瘤细胞系在培养过程中很快便丧失分泌抗体的活性。本文报道一种新的杂交克隆(R27H4)可融合成稳定的杂交瘤细胞系,培养数月仍能持续分泌IgG抗体。     

用软琼脂糖培养与免疫吸附法制备鸡胚视网膜单克隆抗体

细胞融合后,在软琼脂糖培养基上形成杂交瘤克隆,如将附有细胞或其他抗原的滤膜置于培养基表面,杂交瘤细胞分泌的抗体通过扩散与滤膜上的抗原结合,经与~(125)Ⅰ标记的第二抗体反应后,将滤膜进行放射自显影以显示阳性克隆的位置。用本法能快速大规模筛选特异性杂交瘤克隆,已用此法得到多株针对鸡胎视网膜的单克隆抗体。     

抗环孢菌素A单克隆抗体的制备和特性鉴定

目的:制备环孢菌素A(CsA)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:采用光化学反应制备CsA全抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,以ELISA法对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞4E1-C4-E12,细胞培养上清效价、腹水效价分别为1∶200和1∶105,为IgG1类,可特异性识别CsA,与其类似物CsC、CsD交叉反应率为13.3%、21.5%。结论:成功地制备了针对CsA的mAb,为进一步研制检测CsA的ELISA试剂盒奠定基础。     

鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。     

改良的融合技术——Ⅱ杂交克隆的稳定性和纯度

关于产生抗体与杂交瘤细胞生长情况的关系,和融合后产生抗体杂交瘤细胞的均一性及稳定性等方面报导极少.某些作者主张不产生抗体的克隆细胞生长速度超过产生抗体的克隆细胞,但迄今未经实验证明.为了回答这些问题,作者做了两部分试验.一、以不同浓度细胞作融合,然后培养9天,检查产生抗体杂交瘤细胞的形成情况.二、用三种浓度融合后,第11天开始检测,第十四天作有限稀释培养,两周后筛选各孔,用细胞毒试验测定生长孔的上清液.计算每一浓度克隆平均数/孔,并与泊松(Poisson)分     

杂交瘤的制备

二次杂交瘤(hybrid-bybridoma)是由两种细胞融合而成的瘤细胞,可分泌双功能单克隆抗体(bsMcAb)。制备二次杂交瘤的方法主要有两种,一种是杂交瘤细胞与特异抗原免疫的脾细胞融合,另一种是可分泌单克隆抗体的两种杂交瘤细胞融合。本文就目前为止所采用的各种制备二次杂交瘤的方法做一综合性介绍。     

不同杂交瘤饲养细胞上清和条件培养液中IL-2和IL-6水平的比较

本文应用细胞因子依赖细胞株CTLL和7TD1及。~3H-TDR掺入方法,分别对6种常用培养杂交瘤的饲养细胞培养上清和条件培养液中IL-2和IL-6的生物学活性水平进行了定量检测和比较。结果发现,除大鼠混合胸腺细胞培养上清中含有约1u/ml IL-2外,其它均未测出IL-2的生物学活性。但6种上清中都含有IL-6,其中人成纤维细胞CRL_(1506)和人内皮细胞中含有很高水平的IL-6,分别为10000u/ml和2512u/ml;大鼠混合胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞培养上清分别为158u/ml和126u/ml;小鼠脾脏细胞和胸腺细胞培养上清中IL-6相对较低,分别为79u/ml和16u/ml。此外,本文还对常用饲养细胞及条件培养液在杂交瘤细胞生长中可能起的主要作用进行了讨论。     

在无血清培养液(CBSF)中制备单克隆抗体

将已建立能在CBSF培养液中生长传代的Sp2/0骨髓瘤细胞与经TE-1单抗免疫的Wistar大鼠的脾细胞进行异种间细胞融合。TE-1单抗是抗天花粉蛋白IgE单抗,免疫用TE-1单抗是从TE-1小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株诱生的腹水,经过亲和层析分离得到。通过无血清HAT选择培养液筛选,用间接ELISA法检测抗体及四次克隆化,全部过程均在无血清培液中进行,最终得到了能在CBSF中稳定生长,连续分泌抗体的异种杂交瘤细胞株,并能顺利经受液氮保存和复苏。收集杂交瘤细胞培养上清液(CBSF)用硫酸铵沉淀法能得到粗制单克隆抗体。     

贻贝粘蛋白的生物特性及在皮肤色素痣CO_2激光术后创面的临床应用

目的研究贻贝粘蛋白对CO_2激光术后创面愈合的作用。方法 (1)在6孔细胞培养板中加入1.43 mL/孔贻贝粘蛋白溶液温育2 h后弃液,加入细胞浓度为1×10~4/mL处于对数生长期的L929小鼠成纤维细胞株,每孔加入2.5 mL。另取空白6孔细胞培养板,加入相同L929小鼠成纤维细胞株。2个培养板放置于37℃、5%CO_2的细胞培养箱中培养2 h和12 h后观察成纤维细胞的生长情况。(2)2013年10月8日至2013年12月23日在南京医科大学附属无锡人民医院皮肤科门诊就诊的面部色素痣患者入选共计60例,随机分为观察组和对照组,每组30例。两组患者皮肤色素痣部位采用CO2激光仪治疗,观察组即刻在创面处喷涂贻贝粘蛋白,每日3次,对照组不做处理。两组患者创面均暴露直至创面完全上皮化。分别于术后即刻、3、6、9 d测创面面积和深度,计算创面愈合率和创面深度缩减率,观察创面处理后的不良反应,包括创面红肿、感染情况等。两组组间计量资料比较用t检验。结果 (1)贻贝粘蛋白包被的细胞培养板中L929小鼠成纤维细胞培养2 h开始有贴壁现象,培养12 h细胞均处于贴壁生长期;而空白细胞培养板中L929小鼠成纤维细胞培养2 h仍处于悬浮状态,至培养12 h仍有部分细胞未贴壁。(2)术后3、6、9 d,观察组创面愈合率分别为(25.52±4.12)%、(36.95±5.45)%、(43.57±5.43)%均高于对照组(13.46±1.23)%、(20.28±7.54)%、(26.28±3.19)%,差异均具有统计学意义(t=15.36、9.76、15.04,P值均小于0.05);术后3、6、9d,观察组创面深度缩减率分别为(56.38±5.86)%、(81.60±4.43)%、(95.76±2.22)%,均高于对照组(41.56±5.59)%、(62.43±6.21)%、(86.43±4.43)%,差异均具有统计学意义(t=10.02、13.76、10.31,P值均小于0.05)。结论贻贝粘蛋白能够促进CO2激光术后创面的愈合。     

识别人体结肠癌的单克隆抗体

应用人体结肠癌细胞系CL-187与佐剂相混合,免疫BALB/c小鼠。以聚乙二醇(PEG1000)为促融剂,使被免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。细胞融合之后,经HAT选择性培养液培养,去除自身融合和未融合的细胞。用Vectein ABC试剂和间接免疫荧光法检测杂交瘤细胞上清液中的抗体,筛选出呈阳性反应的杂交瘤细胞。再经甲基纤维素培养     

一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用。     

半固体培养基法制备单抗的可行性研究

目的建立稳定的甲基纤维素半固体培养基一步法筛选和克隆化杂交瘤细胞的方法。方法常规细胞融合后,用甲基纤维素半固体培养基重悬细胞沉淀,通过优化甲基纤维素半固体培养基中甲基纤维素、血清及L-谷氨酰胺三种成分的浓度,建立稳定高效的杂交瘤细胞克隆化方法。并进行有限稀释法和甲基纤维素半固体培养基法筛选杂交瘤细胞的对照实验。阳性克隆扩大培养,ELISA检测后冻存,再次复苏后ELISA检测呈阳性为稳定杂交瘤细胞株。结果甲基纤维素三种浓度中,甲基纤维素浓度1．0％和1．2％时获得的杂交瘤细胞团个数约为甲基纤维素浓度1．25％时的2倍。而甲基纤维素浓度1．2％时细胞团固定效果较甲基纤维素浓度1．0％更好。通过对梯度稀释的SP 2／0细胞培养后,选择半固体培养基中使用的胎牛血清浓度（25％）,在半固体培养基中含4mmol／L L-谷氨酰胺比含2mmol／L L-谷氨酰胺得到多近一倍的杂交瘤。得到的5株阳性杂交瘤在扩大培养、冻存复苏后抗体分泌稳定,得到5株稳定阳性杂交瘤细胞株。有限稀释法和甲基纤维素半固体培养基法筛选杂交瘤细胞对照实验显示半固体培养基法可节省一半时间。结论建立了稳定的甲基纤维素半固体培养基一步法筛选和克隆化杂交瘤细胞的方法。该法缩短了克隆化的时间,节省了人力和材料．不需要添加饲养细胞和细胞因子,是一种稳定高效的杂交瘤细胞克隆化方法。