实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应型内鉴定脊髓灰质炎病毒方法的应用

2011年新疆发生输入性脊灰野病毒的疫情后,为了缩短检测时限,中国决定从2013年起启用WHO推荐的《脊髓灰质炎病毒分离新的检测流程》,要求省级脊灰实验室经过培训考核,使用美国CDC研制的实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应     

流行性腮腺炎病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)核酸。方法针对MuV血凝素(H)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、灵敏度与准确性;并通过体外克隆技术建立MuV基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针的优化浓度分别为880mmol/L和280mmol/L,具有良好的保守性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;方法检测灵敏度为10拷贝/反应,相当于0.01TCID50,标准曲线线性范围为107~10拷贝/反应;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。结论TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,为MuV的早期快速检测提供了一种新的检测技术。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.     

流行性感冒病毒应急检测中缩减荧光定量逆转录-聚合酶链反应时间的实验研究

目的在相同的敏感度与特异性条件下,进一步缩减流行性感冒(流感)病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的时间,为应急检测服务。方法缩短荧光定量RT-PCR经典检测方法中不同反应阶段的时间参数,并与经典方法进行比较,考察改良方法的检测敏感性与特异性。结果用经典方法与缩短某些时间参数的改良方法检测甲3型流感病毒,结果其特异性与灵敏度差异无显著的统计学意义,并可将检测时间缩短1h左右。结论适当缩短经典荧光定量RT-PCR方法中的逆转录、变性以及延伸时间后,灵敏度和特异性无显著影响,这对于突发疫情的应急检测具有实用价值。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

TaqMan-MGB荧光定量聚合酶链反应检测水痘-带状疱疹病毒

目的利用TaqMan-MGB探针技术,建立水痘-带状疱疹病毒(VZV)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法,用于临床标本VZV的检测。方法从GenBank上下载几十株VZV基因组序列,在IE62基因的保守区域设计引物与TaqMan-MGB探针,并对反应条件和体系进行优化,同时评价建立检测体系的特异性、敏感性和重复性;利用已知拷贝数的质粒标准品的病毒脱氧核糖核酸(DNA),建立了VZV基因拷贝数定量分析模型。结果该方法与引起相似发病症状的肠道病毒71型,柯萨奇病毒A、B组以及腺病毒均无交叉反应,具有很高的特异性,且灵敏度达到102拷贝,优于常规PCR方法。采用该法对8份疑似水痘、带状疱疹患者疱疹液标本检测均为阳性,较病毒分离、常规PCR法更为简便、快速、敏感。结论该方法适合临床早期感染病例的确认以及水痘、带状疱疹爆发疫情的应急诊断。     

TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测麻疹病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法检测麻疹病毒的核酸,对设计的引物与探针进行筛选与条件优化.结果 Tag Man荧光定量RT-PCR方法具有对麻疹病毒核酸检测的高度特异性与准确性,检测的敏感度可达0.1TCID50,从病毒核酸提取至检测完成仅需3个多小时,操作简便,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会.结论采用Tag Man荧光定量RT-PCR方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测,均获得了满意的结果,为麻疹病毒的分子生物学检测,提供了一种新方法.     

EZH2在子宫内膜癌中表达的意义

目的:探讨EZH2基因在增生子宫内膜、非典型增生子宫内膜、子宫内膜癌中的表达及其与子宫内膜癌发生、发展及预后的关系。方法:采用RT-PCR方法检测21例增生子宫内膜、27例子宫内膜不典型增生及46例子宫内膜癌组织中EZH2 mRNA的表达,并对结果进行统计学分析。结果:EZH2 mRNA在增生子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜癌组织中的表达分别为0.326±0.163、0.548±0.291、0.817±0.126,呈逐渐增高趋势,统计学分析显示各组间差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜癌组中EZH2表达水平与临床各病理参数密切相关,随着组织分化程度降低、肌层浸润加深和手术-病理分期增高EZH2表达逐渐增加(P<0.05);与淋巴结转移无关(P>0.05)。结论:EZH2在子宫内膜腺癌的发生、发展过程中起一定作用,EZH2的过表达促进了肿瘤的发生,它的检测对子宫内膜腺癌的早期诊断、恶性程度的判定有积极意义。     

中国2011年脊髓灰质炎实验室网络的运转与监测

目的对中国2011年脊髓灰质炎（脊灰）实验室网络（Polio Laboratories Network,PLN）监测数据（未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同）进行统计分析,为应对新疆维吾尔自治区（新疆）输入I型脊灰野病毒（Tepe 1 Wild Poliovirus,WPV1）疫情和维持中国无脊灰提供科学支撑。方法分析中国2011年免疫规划监测信息管理系统数据库中,31个省（自治区、直辖市,下同）报告的急性弛缓性麻痹（Acute Flaccid Paralysis,AFP）病例个案调查表和中国疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention,CDC）病毒病预防控制所国家脊灰实验室（National Polio Laboratory,NPL）的监测数据库,评价PLN的各项运转指标。结果中国2011年PLN共收集了6205例AFP病例的12253份粪便标本,合格粪便标本采集率为90．9％。从6089例AFP病例中分离到脊灰病毒（Poliovirus,PV）的207例,分离率为3．4％;分离到非脊灰肠道病毒（Non—polio Enterovirus,NPEV）的782例,分离率为12．8％。NPL收到中国PLN送检的PV594株,鉴定结果：9例为疫苗衍生（Vaccine—derived）PV（VDPV）,其中I型1例,Ⅱ型7例,Ⅲ型1例;53例为WPV1,21例来源于WPV病例,30例来源于AFP病例接触者或健康人群。2份环境污水来源于新疆和田地区环境监测。2011年NPL和31个省级CDC脊灰实验室通过了世界卫生组织（World Health Organization,WHO）PV分离与鉴定的盲样标本考核;NPL还通过了PV荧光定量聚合酶链反应型内鉴定和PV核苷酸序列测定和分析的盲样考核;NPL和13个省级CDC脊灰实验室接受并通过了WHO的现场认证考核。结论中国2011年PLN维持着高水平的运转,及时发现和鉴定了VDPV病例、新疆输入WPV1和局部爆发疫情,为卫生部制订应对WPV和VDPV的免疫策略,为阻断WPV和VDPV的传播提供了重要的科学依据。     

2020年宁夏新冠疫情期间SARS-CoV-2与常见发热呼吸道病原流行特征比较分析

目的 了解2020年宁夏新冠疫情期间SARS-CoV-2与常见6种发热呼吸道病原的检出情况、流行规律和感染特点,为新冠疫情常态化防控提供理论依据。方法 应用Real time RT-PCR技术对2020年1月20日至2020年2月16日期间宁夏疾病预防控制中心收检的COVID-19筛查样本进行SARS-CoV-2和Flu等常见发热呼吸道病原进行定性检测,并收集各病原阳性患者人口学特征资料。结果 529例COVID-19筛查样本中,SARS-CoV-2阳性检出率为13.23%（70/529）。对COVID-19筛查样本中180份符合条件的FRS病例样本进行6种其他呼吸道病毒病原检测,阳性检出率为12.78%（23/180）,其中检出率较高的病原为Flu和HRSV,阳性率分别为5.00%和2.78%。各时间段内SARS-CoV-2阳性检出率存在两个较为明显的峰值,其他呼吸道病毒总阳性检出率稳中有降。SARS-CoV-2阳性检出率男性和女性差异无统计学意义,41~ 60岁组及60岁以上组阳性率较高,分别为25.00%和24.39%,阳性病例在宁夏五市均有分布,银川市最多;其他呼吸道病原男性检出率显著高于女性,41~ 60岁组阳性率最高,其次为0~20岁组,阳性率分别为33.33%和12.20%,阳性主要集中于银川与中卫两市。结论 在常态下防控新冠疫情的背景下,应加强呼吸道传播病原快速筛查体系的建设以达到精准防控传染病的迫切需求。     

2007—2008年河北省急性迟缓性麻痹病例脊灰病毒核苷酸变异情况分析

目的及时发现河北省可能出现的脊灰疫苗衍生病例（VDPV）。方法对河北省2007—2008年急性弛缓性麻痹（AFP）病例的粪便标本进行病毒分离和血清定型。所有标本用L20B、RD细胞同时进行病毒分离,用PCR—RFLP法做型内鉴定。结果从报告的763例AFP病例粪便标本中分离到42株脊髓灰质炎病毒株（PV）,其中Ⅰ型4株,Ⅱ型11株,Ⅲ型11株,混合型13株,PV＋NEPV共3株;将混合株进行单型分离后,共得到58株,以Ⅲ型PV为主,均为疫苗变异株;发病年龄在1岁以内儿童占84．48％,男性发生变异39株,女性发生19株。结论河北省2007—2008年分离到的脊髓灰质炎疫苗病毒有部分变异,未发现疫苗衍生脊灰病毒。     

银川地区儿童感染性腹泻病病原学流行病学的研究

目的探讨银川地区儿童感染性腹泻病病原学分布特点,为临床合理用药提供依据。方法采集2012年4月-2013年4月期间就诊宁夏人民医院门诊及住院的初步诊断腹泻病患儿的新鲜粪便进行细菌培养,同时对所得样本采用RT-PCR技术进行轮状病毒(HRV)、诺如病毒(NORV)、扎如病毒(SPAV)、星状病毒(ASTV)及肠道腺病毒(EADV)检测。结果 286份粪便样本共检测出致病菌208例,检出率72.73%。病毒检测172例阳性,阳性率60.14%,其中HRV84例(29.34%)、NORV62例(21.77%),SPAV14例(4.90%)、ASTV27例(9.44%),EADV 21例(7.34%)。细菌培养致病菌36例,检出率为12.58%,以沙门氏菌感染多见。混合感染36例(12.58%)。结论银川地区儿童感染性腹泻病以病毒感染为主,HRV、NORV为主要致病菌。     

四种食源性病毒多重反转录-聚合酶链反应检测研究

目的 建立同时检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒多重RT-PCR检测方法.方法 以四种食源性病毒的高度保守区为靶序列设计特异引物,优化反应体系和条件,确定多重RT-PCR检测四种病毒的特异性和灵敏度,并初步应用于临床样本中四种病毒的同时检测.结果 在灵敏度试验中得到的轮状病毒、诺如病毒和星状病毒稳定的最高检测限均为50 pg/ml,甲肝病毒为100 pg/ml.在128份临床粪便样本中,其中轮状病毒阳性62份(48.44%),诺如病毒阳性8份(6.25%),星状病毒阳性11份(8.59%),甲肝病毒阳性4份(3.12%).结论 研究所建立的多重RT-PCR方法,在实际应用中能同时处理大量的样本,提高PCR检测方法的能力,可以应用于临床病例的诊断和流行病学调查等研究.     

聚合酶链反应检测与鉴定人流行性感冒病毒

目的 建立一个快速、简单、敏感、特异的实验室检测流感病毒的方法.方法 采用RT-PCR、复合RT-PCR方法和HI试验对流行性感冒病毒的参考株(甲1、甲3和乙型各两株)和分离毒株(甲1型1株、甲3型3株)以及可疑流感患者的喉嗽液标本进行检测.结果 采用RT-PCR方法和复合RT-PCR方法均能检测甲1、甲3、乙型的流感病毒参考株和分离毒株,且能根据扩增物的分子量鉴定出其型别与亚型,其结果与HI法完全相符.复合RT-PCR方法从3例可疑流感患者的喉嗽液标本中检测到阳性结果1例,结果同传统鸡胚分离、HI分型方法相同.结论 本文建立的RT-PCR或复合RT-PCR方法可应用于常见流感病毒的快速检测及初步分型,复合RT-PCR方法具更高的工作效率.     

酶联免疫吸附试验在脊髓灰质炎病毒型内鉴别中的应用

从 2 0 0 1年 10月开始 ,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊髓灰质炎 (脊灰 )实验室 ,增加使用酶联免疫吸附试验 (ELISA)对从急性弛缓性麻痹 (AFP)病例粪便标本中分离到的脊灰病毒进行型内鉴别。 2 0 0 2年6 0 7株单型脊灰病毒的ELISA试验结果是 :5 73株为疫苗相似株 (SL) ,3株为非疫苗相似株 (NSL) ,2 9株为双反应株 (DRV) ,2株为阴性反应株 (NRV)。将ELISA试验结果与逆转录 聚合酶链反应 限制性内切酶片段长度多态性分析 (RT PCR RFLP)结果进行比较 ,发现仅 2株ELISA试验结果为DRV的脊灰病毒 ,PCR结果为变异株。同样 ,在 33株PCR结果为变异株的脊灰病毒中 ,仅有 2株ELISA试验结果为DRV。由于两种方法的原理不同 ,它们得出的结论并无很高的一致性。将ELISA试验结果为NSL和DRV、PCR结果为变异株的毒株进行了脊灰病毒全VP1区核苷酸序列分析 ,在ELISA试验结果为DRV和NSL的脊灰病毒的全VP1区氨基酸序列分析结果中 ,仅有Ⅰ型脊灰病毒的氨基酸变异位点在已知的SabinⅠ型抗原决定簇位点 1(site 1)内 ,Ⅱ型和Ⅲ型的变异位点均不在其中 ,这一矛盾的结果说明 ,可能在VP1区以外其它编码区的抗原决定簇起到主要作用 ,或者试剂盒本身的检测系统存在某些需要改进的地方。在ELISA试验过程中 ,发现Ⅲ型试剂     

Cyr61在子宫内膜癌中的表达及意义

目的:研究Cyr61(Cysteine-rich 61)基因在子宫内膜癌及癌前病变中的表达,与子宫内膜癌发生、发展及预后的关系。方法:采用RT-PCR方法和免疫组化S-P法检测21例正常增生期子宫内膜、27例子宫内膜不典型增生及46例子宫内膜癌组织中Cyr 61的表达情况,观察结果并进行统计学处理。结果:免疫组化S-P法结果显示Cyr 61在增生子宫内膜表达最多,其阳性表达率为90.47%(19/21);不典型增生组织中阳性表达率为66.67%(18/27);子宫内膜癌组织中阳性表达率为23.91%(11/46);不典型增生组显著低于增生子宫内膜,子宫内膜癌组显著低于不典型增生组,3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果与免疫组化法测定的结果相一致,Cyr 61mRNA的表达在增生期子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌患者组织中逐渐降低,统计学分析显示,各组间差异有统计学意义(P<0.05);Cyr 61在子宫内膜癌中表达下降与组织学分级、手术-病理分期显著相关(P<0.05),但与肌层浸润深度、淋巴结转移无关(P>0.05)。结论:Cyr 61在子宫内膜癌和不典型增生中有不同程度的丢失,Cyr 61的低表达促进了肿瘤的发生,检测Cyr 61可成为子宫内膜癌早期诊断及预测癌前病变癌变风险重要指标之一。