1-磷酸鞘氨醇对淋巴管内皮细胞生物学特性调节作用的研究

目的：研究1-磷酸鞘氨醇（S1P）对淋巴管内皮细胞（HDLEC）的生物学特性的调节作用及其调节机制。方法：应用RT-PCR方法检测HDLEC是否表达SPK及S1P受体,应用MTT法、细胞扩散盒技术检测S1P对HDLEC增殖、迁移特性的影响,并用Western印迹方法检测S1P对HDLEC的MAPK信号通路的调节。结果：HDLEC表达SPK及S1P受体,包括S1P1,S1P2,S1P3和S1P4。外源性S1P对HDLEC没有促增殖作用,但可促进其迁移,并可通过S1P1和S1P2诱导MAPK快速磷酸化。结论：初步研究结果提示,S1P可以影响淋巴管内皮细胞的生物学特性,有可能成为调控淋巴管生成及其功能的新靶点。     

高表达鞘氨醇激酶对胃癌细胞生物学特性的影响

目的研究高表达鞘氨醇激酶（SPK）对人胃癌细胞增殖、迁移和凋亡等细胞生物学行为的影响。方法以重组腺病毒为载体,将人野生型（rAd—SPK^WT）及突变体（rAd—SPK^DV）SPK基因导入人胃癌细胞BCC-823。以Western blot检测外源SPK基因的表达,以[γ^82P]ATP掺入法测定SPK酶活性,用迁移扩散盒技术测定细胞的迁移能力。结果重组腺病毒可有效介导SPK在人胃癌细胞BGC-823中的表达。酶活性分析表明野生型SPK基因可增强SPK活性,而突变体SPK基因抑制SPK活性;高表达野生型SPK可以促进胃癌细胞的迁移,抑制5-FU对胃癌细胞的细胞毒作用,而高表达突变体SPK可以抑制胃癌细胞的迁移,增强5FU对胃癌细胞的细胞毒作用。结论SPK可以抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞迁移,有可能成为胃癌新的治疗靶点。     

鞘氨醇激酶1对氧自由基诱导心肌细胞损伤的保护作用研究

目的:研究鞘氨醇激酶1(SPK1)在氧自由基诱导心肌细胞损伤过程中的作用.方法:分离培养Wistar乳大鼠心肌细胞,用不同浓度过氧化氢(H2O2,0, 50, 100, 200, 400 μmol/L)处理细胞,检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放和细胞SPK1酶活性变化;Northern 印迹方法分析SPK1催化产物1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体的表达.用S1P预处理心肌细胞,然后加入100 μmol/L的H2O2继续作用48 h,检测细胞培养上清中LDH的活性;用携带人SPK1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad-SPK1)感染Wistar乳大鼠心肌细胞,然后加入100 μmol/L的H2O2继续作用48 h,检测细胞培养上清中LDH的活性.分析外源性S1P或SPK1高表达对H2O2诱导心肌细胞损伤的保护作用.结果:H2O2作用于心肌细胞后,导致LDH释放增多,SPK1酶活性抑制,其作用呈剂量依赖性;H2O2刺激使S1P受体Edg-1表达水平升高,Edg-3表达水平降低.外源性S1P预处理使H2O2诱导的LDH释放减少,其作用呈剂量依赖性.与对照组相比,Ad-SPK1感染使心肌细胞SPK1酶活性明显升高,细胞培养上清中S1P含量增多,并明显抑制H2O2诱导心肌细胞LDH的释放.结论:SPK1高表达能保护H2O2导致的心肌细胞死亡,这种保护作用主要通过S1P的释放来实现.Edg-1和Edg-3可能参与SPK1对心肌细胞的保护作用.     

鞘氨醇激酶调节细胞凋亡的研究进展

鞘磷脂衍生物神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sp)及1-磷酸鞘氨醇(SIP)在调控细胞增殖、存活及凋亡中发挥着重要作用。鞘氨醇激酶(SPK1)是调控细胞内Cer、Sp、SIP代谢平衡的关键酶。SPK1磷酸化Sp生成SIP，SIP通过细胞内和细胞外作用机制调节细胞生长和凋亡。SPK1参与细胞因子的信号传递。高表达SPK1抑制半胱天冬酶的裂解并上调Bcl-2基因的表达。本文综述了SPK的结构、调控及对细胞凋亡的调节作用。     

鞘氨醇-1-磷酸受体-1促进肿瘤转移与放疗抵抗的研究进展

远处转移是癌症治疗的主要障碍之一。鞘氨醇-1-磷酸受体-1（sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1）在恶性肿瘤中过度表达,通过激活下游信号通路增强细胞侵袭和迁移活性、调控上皮间质转化（EMT）以及诱导淋巴管与血管生成,最终导致肿瘤转移的发生。S1PR1与获得性放射抗性的产生也有密切关联。本文就S1PR1及其在肿瘤转移和放疗抵抗中的作用进行综述。     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

IL-6对人多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用

目的：鞘氨醇激酶是细胞内合成磷酸鞘氨醇的激酶。该酶是细胞迁移、增殖及凋亡调节中发挥重要作用的信号分子。本研究拟确定鞘氨醇激酶在人多发性骨髓瘤细胞的表达及在IL-6信号途径中的作用。方法：采用RT-PCR方法鉴定了鞘氨醇激酶在骨髓瘤细胞的表达情况，通过鞘氨醇激酶活性测定确定IL-6对多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用。结果：人多发性骨髓瘤细胞表达鞘氨醇激酶及S1P受体EDG1，3，5。IL-6通过PI-3K和MAPK激活鞘氨醇激酶。结论：在多发性骨髓瘤细胞中，鞘氨醇激酶参与IL-6的信号转导。鞘氨醇激酶有可能成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点。     

腺病毒介导的鞘氨醇激酶1高表达对心脏缺血再灌注损伤的保护作用观察

目的观察腺病毒介导的鞘氨醇激酶1(SPK1)高表达对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法Wistar大鼠心肌内注射携带人SPK1基因的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-SPK1),以5×109pfu/ml的病毒总量分4点注射,对照组心肌内注射同等量的携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP),3d后进行离体心脏缺血再灌注实验,测定左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP),观察心律失常的发生情况,测定肌酸激酶(CK)的释放水平,用酶学方法检测SPK1的活性,用薄层层析法及Western blot方法检测外源和内源性SPK1在心肌组织的表达。结果心肌内注射Ad-SPK1的大鼠3d后心肌组织SPK1激酶活性明显升高,比对照组升高5倍左右;与对照组相比,注射Ad-SPK1的大鼠心脏对缺血再灌注损伤有明显的抵抗能力,表现在心脏的收缩和舒张功能在缺血和再灌注过程中没有受到明显损伤,心律失常的发生明显减少以及再灌注过程中CK释放明显减少。结论腺病毒介导的SPK1基因转染能预防缺血再灌注导致的心脏损伤。     

鞘氨醇代谢物——肿瘤治疗的新靶点

神经鞘脂类是细胞膜的结构成分之一。其代谢产物如神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇亦是具有生物活性的信号分子,可作为第一和（或）第二信使调控着细胞的生命活动,如细胞的增殖、存活、迁移、新生血管形成。鞘氨醇激酶1是调节神经酰胺、1-磷酸鞘氨醇平衡的限速酶。近年研究表明,神经酰胺、鞘氨醇激酶1、1-磷酸鞘氨醇可调控肿瘤细胞代谢的多个环节,由此提示神经鞘脂类代谢产物可作为肿瘤治疗的新靶点。     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）基因表达对血管平滑肌（VSMC）增殖,迁移和凋亡等生物学行为的影响,用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染VSMC,用流式细胞仪检测AT2R转染表达率,RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,VSMC增殖用MTT比色法和5－溴脲苷（BrdU)掺入法检测,迁移用改良Boyden趋化小室法检测,细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测,结果表明,AdCMV-AT2R转染后,VSMC表达率为89．51％,AT2R峰值表达时,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．4％和51．6％（P＜0．01）VSMC的跨膜迁移数减少62．2％（P＜0．05）。细胞凋亡增加约3．2倍,bax表达增加76．3％（P＜0．05）。提示AT2R表达可介导报制VSMC的增殖和迁移,并诱导其发生凋亡。     

1,25（OH）2D3对人血管平滑肌细胞TLR4基因及炎症因子表达的抑制作用

目的探讨1,25（OH）2D3（1,25-dihydroxyvitamin D3）对人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic vascular smooth muscle cell,HA-VSMC）果蝇样受体（Toll like receptor 4,TLR4）基因及其下游炎症因子IL-6、IL-8和MCP-1表达的调节作用。方法不同浓度1,25（OH）2D3干预HA-VSMC后,采用实时荧光定量PCR法检测细胞TLR4、IL-6、IL-8、MCP-1mR-NA的表达水平。结果 1,25（OH）2D3在浓度为1-20nmol/L之间抑制TLR4、IL-6、IL-8、MCP-1mRNA水平的表达且具有明显的剂量依赖关系。在浓度为1nmol/L时1,25（OH）2D3下调TLR4和MCP-1mRNA表达的作用最明显,浓度为10nmol/L时,1,25（OH）2D3下调IL-6mRNA表达的作用最明显,浓度为20nmol/L时,1,25（OH）2D3下调IL-8mRNA表达的作用最明显。TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1mRNA表达的最大下调幅度分别为对照组的3.08、2.39、3.19、2.23倍（均P〈0.05）。结论 1,25（OH）2D3通过下调TLR-4信号抑制了人主动脉血管平滑肌细胞的炎症反应。     

Ox-LDL对主动脉平滑肌细胞中ABCA1及炎性因子表达的影响

 目的 研究氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导作用下,ATP结合盒转运子A1(ABCA1)对人主动脉平滑肌中单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA和蛋白质及白介素-1β(IL-1β)表达的影响.方法 复苏培养人主动脉平滑肌细胞CC2571、Ox-LDL (30 μg/ml) 刺激3、6、12、24 h后,以荧光定量RT-PCR法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA表达,Western蛋白印迹法及ELISA法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β蛋白质表达;用ABCA1的反义寡核苷酸抑制ABCA1表达后,观察上述指标的变化.结果 予Ox-LDL刺激后, CC2571细胞中ABCA1、MCP-1、ICAM-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增加,反义寡核苷酸转染后3、6 h时上述指标的mRNA表达降低,12、24 h蛋白质表达降低.结论 Ox-LDL诱导主动脉平滑肌细胞炎性因子的表达,ABCA1可能通过增强上述炎性因子表达参与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生.     

IL-2促进大鼠子宫平滑肌细胞增殖及IL-2R的表达

目的：研究白细胞介素-2(IL-2)对大鼠子宫平滑肌细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制。方法：以培养的大鼠子宫平滑肌细胞进行了以下实验：以MTT比色法，测定IL-2对该细胞增殖的剂量效应；用流式细胞技术，观察IL-2对该细胞细胞周期各阶段DNA含量的影响；用激光共聚焦显微镜技术，检测IL-2对该细胞内Ca^2 水平的影响；用RT-PCR技术，检测IL-2R在该细胞的表达。结果：IL-2(10～1000U／ml)可显著促进大鼠子宫平滑肌细胞的增殖。用流式细胞技术检测细胞中DNA的含量发现，IL-2(100 U／ml)可提高该细胞由G1期进入S期的比例。激光共聚焦法检测到IL-2(100U／ml)可升高细胞内的Ca^2 浓度。RT-PCR技术检测到细胞表达IL-2R a mRNA、IL-2RβmRNA和lL-2R γmRNA三条链。结果：IL-2参与了对大鼠子宫平滑肌细胞增殖的调节，其促进增殖作用可能与该细胞周期DNA含量的变化、Ca^2 浓度的改变和IL-2R的表达有关。     

转录调节因子Ets-1在血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用

目的　研究转录调节因子Ets 1对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖与凋亡的影响及其可能的机制。方法　采用定量细胞DNA片段的方法观察转染质粒Ets 1后VSMC增殖与凋亡情况 ,观察共转染Ets 1和反义P2 1WAF1 CIP1对细胞增殖与凋亡的干预作用。应用Western印迹法研究转染质粒Ets 1后磷酸化视网膜母细胞瘤 (RB P)蛋白表达情况。结果　定量细胞质DNA片段方法发现Ets 1抑制VSMC凋亡。反义P2 1WAF1 CIP1能够阻断Ets 1的抗凋亡作用 ,并抑制Ets 1诱导的VSMC增殖。Western印迹法发现Ets 1能够上调RB P蛋白表达 ,反义P2 1WAF1 CIP1可以阻断视网膜母细胞瘤 (RB)蛋白磷酸化。结论　在VSMC中 ,Ets 1通过P2 1WAF1 CIP1旁路发挥抑制凋亡和促进增殖作用     

滨蒿内酯对大鼠哮喘模型气道平滑肌增殖及PKC-α蛋白表达的影响

目的观察滨蒿内酯对哮喘大鼠气道壁平滑肌增殖及PKC-α（protein kinase C-α,蛋白激酶C-α）表达的影响,探讨滨蒿内酯治疗哮喘的作用机制。方法40只雄性大鼠随机分成4组：正常对照组（N组）、哮喘组（A组）、地塞米松治疗组（D组）及滨蒿内酯治疗组（S组）,以卵清蛋白致敏和激发方法建立哮喘大鼠动物模型并给予相应治疗。测定各组肺功能,检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数及嗜酸粒细胞（EOS）计数;用免疫组化法检测PKC-α蛋白表达水平、光镜下测定平滑肌层厚度及内外径。结果大鼠致敏2周及诱发哮喘4周后,肺功能测定表现为呼气时间延长,呼气峰压明显增大;A组BALF中的白细胞总数及Eos计数均较N组明显升高。哮喘模型组气道壁PKC-α蛋白含量和平滑肌层厚度较正常组均显著增加（均为P〈0.001）,气道内外径比值较正常组减小（P〈0.001）。气道壁平滑肌层厚度与PKC-α蛋白表达呈正相关（rs=0.771,P〈0.01）。结论滨蒿内酯能减轻哮喘大鼠气道壁平滑肌层的增厚并抑制PKC-α的表达。