双氢青蒿素对γδT细胞杀伤SW1990细胞的增强作用

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人外周血γδT细胞体外增殖及抗肿瘤活性的影响.方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和IL-2的RPMI 1640完全培养基中诱导培养γδT细胞.不同浓度的DHA作用于γδT细胞4δ h后,MTT法检测各药物浓度组γδT细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测各组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达,用CCK-8试剂盒检测各组γδT细胞对SW1990细胞的体外杀伤效应.结果 培养8d时各组γδT细胞纯度达到了75.46％ ±5.32％.浓度为50～100μmol/ml的DHA能显著促进γδT细胞的增殖.DHA处理后γδT细胞杀伤胰腺癌SW1990细胞能力及其穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达均显著高于对照组.结论 DHA可增强γδT细胞抗肿瘤活性,其机制可能与其促进γδT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达上调有关.     

辣椒素对人γδT细胞杀伤人骨肉瘤HOS细胞的影响

探讨辣椒素对人γδT细胞体外增殖及杀伤骨肉瘤细胞的影响及作用机制。分离健康人PBMC,加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和IL-2的DMEM-F12完全培养基中诱导培养γδT细胞。不同浓度的辣椒素作用于γδT细胞48h后,CCK-8法检测各药物浓度组γδT细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测各组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a及IFN-γ的表达,用LDH释放法检测各组γδT细胞对骨肉瘤HOS细胞的体外杀伤活性。结果显示,培养7d时各组γδT细胞纯度达到了(85.33±6.07)%。浓度为3.2~50μmol/L的辣椒素能显著促进γδT细胞的增殖,在浓度为25μmol/L时其穿孔素、颗粒酶B、CD107a及IFN-γ的表达均显著高于对照组,且对人骨肉瘤HOS细胞的体外杀伤活性显著增强。以上结果提示辣椒素在体外能通过促进γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的表达上调显著增强其抗骨肉瘤细胞活性。     

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。     

白藜芦醇对γδT细胞杀伤结肠癌SW-1116细胞的影响及机制研究

目的 观察白藜芦醇作用前后γδT细胞对结肠癌SW-1116细胞杀伤活性的变化,并探讨其发生的机制。方法 异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞,不同浓度的白藜芦醇作用于γδT细胞和结肠癌SW-1116细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测白藜芦醇对γδT细胞及结肠癌细胞的生长的影响;流式细胞术(FCM)检测白藜芦醇作用前后γδT细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达;乳酸脱氢酶( LDH)释放法检测白藜芦醇对γδT细胞杀伤结肠癌SW-1l16细胞活性的影响。Western blot检测药物作用前后γδT细胞细胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白的活性的变化。结果 白藜芦醇在0.39 ～3.125μmol/L时对γδT细胞的生长具有促进作用,对结肠癌SW-1116细胞作用不明显;经白藜芦醇诱导后γδT细胞的穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达显著高于对照组(P＜0.05);对结肠癌SW-1116细胞的杀伤活性也显著高于未诱导组(P＜0.05);经浓度为0.1～10 μmol/L白藜芦醇作用的γδT细胞的p-ERK1/2表达较对照组增加(P＜0.05)。结论 白藜芦醇能够促进γδT细胞的增殖,并增强其对结肠癌SW-1116细胞的杀伤能力,其机制可能与上调γδT细胞表面的穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达及活化细胞外信号调节激酶等有关。     

Gardiquimod增强人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的研究

目的研究Toll样受体7激动剂(Gardiquimod)对人γδT细胞杀伤肿瘤作用的影响。方法以异戊烯焦磷酸法扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的Gardiquimod处理γδT细胞和肺癌细胞A549,MTT法检测细胞增殖情况。LDH法检测Gardiquimod处理后γδT细胞对A549的杀伤活性;流式细胞术检测处理前后γδT细胞上CD107a、穿孔素和颗粒酶的表达情况。结果 Gardiquimod在5.0~0.31μg/ml浓度可明显促进γδT细胞增殖,同时抑制A549增殖。Gardiquimod处理γδT细胞后,杀伤A549能力明显增强,且CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达显著升高,与对照组相比,有统计学差异(P<0.05)。结论 Gardiquimod通过增高γδT细胞上的CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达来增强其杀伤肿瘤作用。     

人外周血NK细胞在细胞因子刺激下扩增后穿孔素、颗粒酶B基因表达的变化

目的 探讨经过纯化及在多种细胞因子的作用下扩增后的NK细胞,其穿孔素(per-furin)、颗粒酶B(granzyme B)表达水平的改变与细胞杀伤率的关系.方法 应用竞争性定量RT-PCR方法 检测了8例供者纯化、扩增后NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平,同时检测其对K562细胞的杀伤率.结果 经纯化、扩增后的NK细胞,在多种细胞因子作用下穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平明显提高,且.IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组基因的表达量均显著高于其他组,NK细胞对K562的杀伤率结果 与基因表达水平一致.结论 应用细胞因子后可使NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平明显提高,同时提高了NK细胞的杀伤功能.     

糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119联合细胞因子促进CD45RA~+CD62L~+γδT细胞分化及功能

目的体外研究糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119联合细胞因子IL-7、IL-15和IL-21对CD45RA~+CD62L~+γδT细胞分化、凋亡及其功能的影响。方法采用帕米磷酸二钠和IL-2体外扩增健康人外周血单个核细胞中的γδT细胞或联合加入IL-7、IL-15、IL-21和TWS119进行诱导培养。采用细胞计数仪和流式细胞仪检测各培养组中γδT细胞的增殖、分化、凋亡、细胞因子分泌及其杀伤肿瘤活性。结果 IL-7、IL-15和IL-21联合TWS119可以促进γδT细胞分化、增殖和抗凋亡能力,尤其在TWS119+IL-7/15/21联合组中,CD45RA~+CD62L~+γδT细胞的比例与数量最高,且该群细胞在体外具有持续的增殖、IFN-γ分泌和杀伤人肝癌HepG2细胞活性。结论在帕米磷酸二钠和IL-2的培养条件下,TWS119体外联合细胞因子IL-7、IL-15和IL-21可以有效扩增CD45RA~+CD62L~+γδT细胞,为后期该群细胞体内抗肿瘤活性研究和临床应用提供依据。     

帕米膦酸二钠与唑来膦酸对体外培养人γδT细胞的杀伤功能影响比较

目的比较帕米膦酸二钠与唑来膦酸体外培养人γδT细胞的杀伤功能。方法用帕米膦酸二钠与唑来膦酸分别扩增人外周血γδT细胞。用CCK-8检测细胞增殖情况;第10天流式细胞术检测帕米膦酸二钠与唑来膦酸培养的γδT细胞的穿孔素、颗粒酶B、CD107a和CD178的表达情况。CCK8法检测诱导后γδT细胞对肺癌细胞株A549、胃癌细胞株SGC-7901、胰腺癌细胞株SW-1990的杀伤活性。结果帕米膦酸二钠较唑来膦酸组(P0.05)能明显提高γδT细胞的表达。唑来膦酸组在γδT细胞颗粒酶、CD107a和CD178表达明显高于帕米膦酸二钠组,但是穿孔素的表达无显著性差别(P0.05)。结论唑来膦酸培养的γδT细胞一些功能表达明显表面高于帕米膦酸二钠组。但在效靶比低于20∶1时,二者培养的γδT细胞对A549、SGC-7901、Sw-1990的杀伤活性上无明显差异(P0.05)。当效靶比高于20∶1时,唑来膦酸组的杀伤活性高于帕米膦酸二钠组(P0.05)。     

金丝桃苷增强人γδT细胞增殖及杀伤功能研究

目的:研究金丝桃苷对人γδT细胞增殖及功能的影响。方法:以异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的金丝桃苷处理,CCK-8法检测细胞增殖。LDH法检测金丝桃苷对前列腺癌细胞DU-145的杀伤活性。流式细胞仪检测处理前后γδT细胞上穿孔素、颗粒酶、CD107a、IFN-γ的表达情况。结果:异戊烯焦磷法能在体外成功培养出高纯度的γδT细胞。金丝桃苷在μg/ml范围内可显著促进γδT细胞增殖。金丝桃苷作用于γδT细胞后杀伤DU-145的能力明显增强,且在3.13~12.5μg/ml浓度时γδT细胞上颗粒酶、穿孔素、IFN-γ的表达显著升高,与对照组相比有统计学差异。金丝桃苷对γδT细胞上CD107a的表达无明显影响。结论:金丝桃苷通过增强γδT细胞上颗粒酶、穿孔素、IFN-γ的表达来增强其杀伤DU-145的作用。     

双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究

为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力。采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达。对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化。结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化。γδT细胞CD69表达增长5倍。NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高。提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗。     

不同抗凝剂对外周单个核细胞增殖影响比较、γδ T细胞鉴定

目的探讨3种抗凝剂保存的外周血对培养γδT细胞的增殖和杀伤功能的影响研究。方法选择获得知情同意的6例健康志愿者,其中男性3例,女性3例;年龄25~45岁。常规无菌抽取新鲜外周血15 mL。将其外周血标本分别置于肝素钠、细胞保存液(枸橼酸钠)和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂中(即肝素钠组、细胞保存液组、EDTA组),并立即处理培养细胞,用CCK-8法检测3组细胞的增殖情况。在第10天,行流式细胞术检测3组γδT细胞的穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达。结果在外周血细胞培养过程中,EDTA组细胞增殖不明显;肝素钠组和细胞保存液组细胞增殖明显,在第14天细胞增殖倍数最大分别为137.00%±1.44%和99.00%±1.45%,且肝素钠组优于细胞保存液组(t=2.72,P0.01)。流式细胞仪检测发现肝素钠组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达都明显高于细胞保存液组(t=3.871,P=0.003;t=2.744,P=0.021;t=2.261,P=0.047)。结论肝素钠和细胞保存液均可用于γδT细胞培养的血液抗凝,但肝素钠保护γδT细胞的杀伤功能明显优于细胞保存液。     

MCMV早期感染对小鼠CD8~+ T、γδT和NK细胞功能的影响

目的通过体内和体外实验观察小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)早期感染对小鼠脾脏CD8~+ T、γδT和NK细胞亚群和功能变化的影响,以将感染增强免疫细胞功能的方法作为提高机体抗肿瘤免疫效应途径的理论基础。方法分别用5×10~4PFU(A组)、5×10~5PFU(B组)MCMV和无菌PBS(C组)腹腔注射小鼠,体内感染9 d;用1×10~4PFU(D组)、1×10~5PFU(E组)和1×10~6PFU(F组)MCMV感染离体小鼠脾脏淋巴细胞24 h和48 h,同时设置空白对照组(G组)。多色流式细胞术检测脾脏淋巴细胞表型和功能,ELISA检测体内感染组IFN-γ、IL-2和颗粒酶B的水平。结果与C组比较,MCMV体内感染小鼠后,MCMV特异性CTL,B组CD8~+ T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和表达的颗粒酶B,A、B组γδT细胞表达的颗粒酶B、CD107a,B组NK细胞表达的CD107a水平均增加;A、B组未成熟NK细胞数减少,但成熟1阶段NK细胞明显增加;以上指标在A、B组间均无差异。ELISA结果提示A、B组IFN-γ、IL-2和颗粒酶B水平均较C组升高,且随病毒滴度增加而升高。与G组相比,体外感染24 h和48 h后D、E、F组CD8~+ T细胞表达的CD69,24 h后CD4~+ T细胞表达的CD69,24 h后F组CD8~+ T细胞分泌的IFN-γ,24 h和48 h后各感染组CD8~+ T细胞分泌的TNF-α以及24 h后D、E组CD4~+ T细胞分泌的TNF-α均增加,CD8~+ T细胞和CD4~+ T细胞各组间IL-2分泌和颗粒酶表达未见明显差异;与G相比,体外感染24 h和48 h后各感染组均可见NK细胞IL-2和颗粒酶B水平升高;以上表面分子、细胞因子和颗粒酶B的表达水平普遍随着病毒滴度的增加而升高。结论MCMV早期感染后CD8~+ T、γδT和NK细胞功能可能较前增强,这将为抗肿瘤免疫治疗提供理论基础。     

病毒灭活血浆对人γδT细胞功能影响的实验研究

目的探讨病毒灭活血浆对人γδT细胞生长和功能的影响。方法取人外周血γδT细胞,用异戊烯焦磷酸法体外扩增。用10%病毒灭活血浆和10%新鲜冰冻血浆分别培养γδT细胞,分别检测培养前、培养5d和10d后的扩增倍数;用流式细胞术分别检测培养10d后的γδT细胞表面标记,即颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达等。结果 10%新鲜冰冻血浆和10%病毒灭活血浆对人γδT细胞培养10d时,由扩增前的3.12%增加到80.46%和81.18%,5d和10 d的细胞增殖倍数分别为11.65±2.11、38.21±1.57和11.77±2.13、37.11±1.81,CD107a、穿孔素、颗粒酶B含量表达分别为90.54%±1.99%、23.47%±3.18%、35.47%±2.42%和90.22%±2.21%、22.58%±3.41%、34.63%±2.22%,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论病毒灭活血浆在一定浓度下对人γδT细胞生长、增殖,颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达与新鲜冰冻血浆无明显差异。     

K652重组表达IL-6基因对NK细胞表型和功能的影响

目的:为了研究表达IL-6的重组K562细胞对自然杀伤细胞(NK)细胞的扩增数量、表型和功能的影响。方法:根据人类IL-6 c DNA的5'端序列,设计PCR引物以K562细胞c DNA文库的DNA为模板进行扩增,表达,转染,在K562细胞上表达IL-6基因,构建重组的K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。流式细胞仪分析NK细胞表型。将NK细胞作用到K562细胞,对其杀伤性进行功能分析,51Cr释放实验检测NK细胞对K562细胞杀伤水平的影响。结果:成功构建了表达IL-6的重组K562细胞,和PBMC共同孵育后,培养体系经过21 d的刺激后,IL-6重组K562细胞诱导PBMC扩增,CD56+CD16+CD3-细胞数量比诱导前扩增了(760±18)倍,CD56+CD16+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的6%±0.4%,扩增后第3组结果比未扩增的多了91%±2%。细胞毒实验表明,在NK效应细胞∶K562靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了92%±2%。结论:本方法以重组K562为刺激细胞,能够实现NK细胞体外的大规模制备,建立了优化的NK细胞体外扩增方法,且扩增的细胞杀伤K562细胞的活性较好。对于NK的大量扩增和应用于临床具有重要的指导意义。     

PD-1受体在HBV—ACLF患者外周血CD8^＋T细胞上的表达研究

目的探讨乙型肝炎病毒所致慢加急性肝衰竭（HBV—ACLF）患者外周血中CD8^＋T细胞上PD-1（Programmed death-1）的表达以及对CD8^＋T细胞的影响。方法收集60例HBV—ACLF患者外周血;应用流式细胞仪检测外周血中CD8^＋淋巴细胞上的PD-1、CD95、穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、CD107a的表达以及CD14细胞上PD—L1的表达;根据不同病情分期和不同预后比较各分子的表达差异;设15名肝硬化患者及15名健康人为对照组。结果（1）HBV-ACLF患者CD8^＋T细胞上PD-1较肝硬化组和健康组表达上调（P〈0．05）;好转组PD-1表达率低于无效组（P〈0．05）;早、中、晚三期PD-1表达率呈上升趋势（P〈0．05）;（2）PD—L1在好转组及病情早期表达相对最低;（3）PD-1与CD95在死亡组表达明显升高;穿孔素、颗粒酶及CD107a在死亡组表达升高,但PD-1在这三类细胞上表达率非常低。结论PD-1在HBV．ACLF患者外周血CD8^＋T细胞上表达上调,且与病情严重程度呈正比。其上调表达可能促进总CD8^＋T细胞的凋亡,但对于具有杀伤活性的CD8^＋T细胞抑制作用相对较弱。     

儿童EB病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生症NK细胞表面受体和CD107a表达

目的研究儿童EB病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生症（EBV-HLH）NK细胞表面受体和CD107a表达,为深入了解EBV-HLH发病机制提供理论依据。方法选取2009年8月至2011年5月于北京儿童医院确诊为EBV-HLH、未接受过化学免疫治疗的住院患儿为EBV-HLH组,选取年龄、性别与EBV-HLH组1∶1匹配的健康查体儿童为正常对照组。应用流式细胞仪检测NK细胞表面受体、穿孔素及CD107a表达。予IL-2刺激后再次测定CD107a表达情况。结果 EBV-HLH组和正常对照组各8例。①两组NK细胞表面受体NKp30、NKp46、NKG2D、DNAM-1和2B4表达阳性率差异均无统计学意义,CD56＋NK细胞穿孔素表达率和CD8＋T细胞穿孔素表达率差异均无统计学意义。②两组在IL-2刺激前CD107a、CD107a/K562、CD107a/2B4/P815、CD107a/NKG2D/P815和CD107a/2B4/NKG2D/P815表达率差异均无统计学意义。③EBV-HLH组在IL-2刺激前后CD107a表达差异无统计学意义;正常对照组IL-2刺激前后CD107a、CD107a/K562和CD107a/NKG2D/P815表达率差异有统计学意义。结论 EBV-HLH患儿NK细胞对IL-2的反应出现异常,可能与EBV-HLH的发生有关。     

2-脱氧葡萄糖对体外培养人γδT细胞CCR5表达及杀伤功能影响

目的:观察糖基化抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)对γδT细胞增殖、趋化因子受体CCR5和杀伤功能的影响。方法:从健康人外周血中分离单个核细胞,加入到γδT细胞完全培养基培养获得γδT细胞。用不同浓度的2-DG诱导培养γδT细胞48 h后,用CCK-8法测定不同浓度2-DG组的γδT细胞增殖和杀伤能力;用流式细胞术检测γδT细胞CCR5的表达和杀伤功能指标的影响。结果:培养10 d后的γδT细胞纯度达到(88.18±3.41)%。2-DG浓度在0~1.0 mmol/L时对γδT细胞的增殖影响不明显,而当浓度大于1.0 mmol/L后能显著抑制γδT细胞的增殖。2-DG浓度在0~2.0 mmol/L范围内能促进CCR5的表达,且在0.5和1.0 mmol/L时能促进杀伤指标CD107a和穿孔素的表达及对结肠癌HCT116细胞的杀伤能力。结论:2-DG能促进γδT细胞表面趋化因子受体CCR5的表达,且在一定浓度范围内能提高γδT细胞的体外杀伤功能。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较北大核心CSCD

目的分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4^+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较

目的 分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法 采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4~+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

MAPK信号转导途径在Mtb-Ag激活的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用

目的：探讨MAPK信号转导途径在结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用。方法：用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增，并用磁珠阳性分选法分离高纯度的γδT细胞；用MTT比色法测定γδT细胞对肿瘤细胞系K562和Raji的细胞毒活性，并观察MEK／Erk特异性抑制剂PD98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580，对细胞毒活性的阻断作用：用流式细胞仪检测肿瘤细胞诱导γδT细胞上CD69的表达，并观察PD98059和SB203580对CD69表达的抑制作用。结果：新鲜分离的PB-MC，用Mtb-Ag刺激培养第10天，用磁珠阳性法分离的细胞中γδT细胞的比率，分别为3．56％、74．63％和98．20％。PD98059可抑制γδT细胞的杀瘤活性，且对γδT细胞杀伤Fas低表达的K562细胞的抑制率(39．27％)高于对γδT细胞杀伤高表达Fas的Raji细胞的抑制率(26．58％)。PD98059还能明显抑制肿瘤细胞诱导γδT细胞表达CD69；而SB203580对γδT细胞的杀瘤活性和肿瘤细胞诱导的CD69的表达均无影响。结论：MAPK途径中的Erk通路(而不是p38通路)参与了γδT细胞对肿瘤细胞细胞毒活性的启动，且可能对γδT细胞的颗粒外吐作用较大，而对Fas／FasL介导的细胞毒活性的作用较小。MAPK途径的Erk通路可能还参与肿瘤细胞诱导γδT细胞的活化。