血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定

背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用,但重组A1在原核中多为包涵体表达,不利于纯化及体外的功能研究。目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S,并研究其生物学功能。方法：将血管性血友病因子A1（野生型）、血管性血友病因子G1324S（功能失去型突变体）重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中,筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌（E.coli）BL21、E.coli M15中,筛选挑单克隆菌于LB培养基,扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法,使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达,经过Ni柱亲和层析纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性;采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下,血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1,6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品,并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示,对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较,随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa,G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度（46.8%）要远高于野生型组（20.5%）,说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致,野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素（GNLY）质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2（IL-2）刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,得到重组质粒pET28a（＋）-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍（Ni）亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot）进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a（＋）-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞活性的研究打下了基础。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( )中,得到重组质粒pET28a( )-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Westernblot)进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a( )-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础。     

SOCS-3在脓毒症患者外周血单个核细胞中表达的研究

目的探讨细胞因子信号转导抑制因子-3（SOCS-3）在脓毒症发病机制中的作用。方法选择36例脓毒症患者,30例健康志愿者为对照组,应用RT-PCR方法测定SOCS-3在外周血单个核细胞中的表达,并和患者APACHEⅡ评分进行相关分析。结果SOCS-3在脓毒症组和对照组的外周血单个核细胞中均有表达,脓毒症组较对照组表达显著增加（P〈0．001）,SOCS-3 mRNA的表达和脓毒症A—PACHEⅡ评分呈负相关,相关系数（r）为-0．746（P〈0．01）。结论SOCS-3参与了脓毒症的发病过程,SOCS-3的表达在脓毒症患者中可能起着保护作用。     

外周血Survivin mRNA表达与胃癌的关系

目的探讨外周血中Survivin mRNA表达与胃癌的关系。方法以GAPDH作内参照,应用实时定量RT-PCR技术检测55例胃癌化疗前及病情进展后患者外周血中Survivin mRNA表达水平。结果化疗前Survivin mRNA表达水平为0.6012±0.0496,疾病进展后Survivin mRNA表达水平为0.7190±0.0961（P〈0.05）。回归分析发现,Survivin mRNA的表达水平及分期是影响胃癌预后的独立因素。结论外周血Survivin mRNA可以作为胃癌早期诊断,判断胃癌复发或转移及预后的客观指标之一。     

广西百色市3个民族人群RhD阴性和弱表达D表型分布的比较研究

目的 对广西百色市壮、汉、苗族人群的Rh血型分布进行调查并与弱表达D表型的分布进行比较研究.方法 ABO血型采用正定玻片法,Rh血型采用Rh抗D单克隆抗体测定,另外对RhD阴性个体应用聚合酶链反应(PCR-SSP)技术检测RhD基因外显子和RhCE基因.结果 居住在广西百色市的壮、汉、苗族人群RhD阴性率分别为3.86%、0.93%、8.79%,d基因频率分别为0.187、0.079、0.215.壮族人群RhD阴性血清学表型分布极不平衡,以cde多见,占56.1%,Ccde次之,占29.1%,其他表现型频率较低;34例弱D标本血清学表型主要为cDEe(47.1%)和CcDe(38.2%),其他表型所占频率较少.结论 广西百色市壮、苗族等少数民族人群的Rh血型比例较高,可能与本地区Rh溶血症发生率相对较高相关,因此常规检查Rh血型对避免Rh血型不合引起的溶血性输血反应、新生儿溶血具有重要意义.     

Beta-integrin of Anopheles gambiae: mRNA cloning and analysis of structure and expression

We have isolated an mRNA encoding a β integrin subunit of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Our analysis predicts a protein that is very similar to β_PS, the fruitfly orthologue. The gene is expressed during all developmental stages and it is found in all body parts, including the midgut. Finally, the expression of the gene does not seem to be modulated during blood meals, except for a substantial increase 48 h posthaematophagy, when digestion is nearly complete.     

Survivin 在肾细胞癌患者手术前后外周血中的变化研究

目的：探讨 Survivin 在肾细胞癌（RCC）患者手术前后外周血液中的表达变化及其意义。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测30例 RCC 行肾癌根治术患者和10例非肿瘤原因切肾患者术前1 d、术后第7天外周血中 Survivin 含量表达变化情况。结果10例非肿瘤原因切肾患者术前1 d、术后第7天外周血中Survivin 的含量分别为（10．90±14．69）pg/mL、（5．00±10．58）pg/mL;30例 RCC 患者术前1 d、术后第7天外周血中 Survivin 的含量分别为（125．80±49．28）pg/mL、（31．53±23．70）pg/mL。对照组术前、术后相比,差异无统计学意义（P ＞0．05）。RCC 组术前、术后相比,术后明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05）。对照组与 RCC 组相比,术前术后相比差异均有统计学意义（P ＜0．05）。结论肾细胞癌根治术后,Survivin 在外周血中含量随之明显下降,进一步说明了 Survivin 与 RCC 的预后有一定的关系。测定外周血中 Survivin 含量可作为监测肿瘤发生和预后的一个重要指标,将有助于肿瘤的早期诊断和预后的评估。     

Aedes aegypti transferrin. Gene structure, expression pattern, and regulation

Mosquitoes and all other insects so far examined have an abundant haemolymph transferrin (Tsf). The exact function of these proteins has not been determined, but they may be involved in iron transport, in oogenesis and in innate immune defence against parasites and pathogens. The Tsf gene of Aedes aegypti has been cloned and sequenced. It contains a single small intron, which contrasts it to vertebrate Tsf genes that contain up to sixteen introns. The promoter region of the gene is rich in putative NF-kappaB binding sites, which is consistent with the postulated role of Tsf in insect innate immunity. Tsf message levels are very low in embryos and early larvae, but high in late larvae, pupae and adults. Western blotting experiments revealed high levels of Tsf protein in pupae and adults. Late larvae and ovaries of blood-fed mosquitoes have little intact protein, but two prominent proteolytic degradation products. These may represent biologically active peptides, as has been shown for other organisms. Tsf message is down-regulated by inorganic iron in the diet or environment, but up-regulated by a blood meal in the adult female. The up-regulation following a blood meal may, in part, be due to the decrease in juvenile hormone (JH) that is known to follow blood feeding. Treatment of blood-fed females with methoprene, an analogue of JH, resulted in decrease of the Tsf message.     

60Co辐照血红细胞CR1分子数目的变化

目的研究不同剂量60Co γ射线辐照全血在保存期内红细胞CR1分子数目的变化.方法应用酶联法定量测定经15～35GY五个照射剂量辐照全血在保存期内红细胞CR1分子数目.结果照射后1d,15～25GY剂量组红细胞CR1分子数目相互间比较及分别与对照组比较无明显差异(P＞0.05);经30、35GY辐照红细胞CR1分子数目分别与其他剂量组和对照组比较有明显差异(P＜0.05～0.01).另外,随着保存期的延长,各剂量组和对照组红细胞CR1分子数目呈阶梯式下降,尤其在照射后3d,30和35GY剂量组红细胞CR1分子数目接近于照射后7d水平,二者相互比较无明显差异(P＞0.05).结论在一定范围内(15～25GY)60Co γ射线剂量辐照对红细胞CR1分子数目无明显影响.     

外周血基因转录本检测中2种标本处理方法的比较

目的　选择合理的标本处理方法 ,提高外周血基因转录本检测的灵敏度。方法　 5 3例胃癌患者外周血标本分别以淋巴细胞分离液 (FICOLL)和红细胞裂解液 (RLS)处理后提取RNA ,以荧光定量RT PCR技术检测 β actin基因和CEA基因转录本。 结果　RLS法和FICOLL法定量检测 5 3例外周血标本的 β actin基因转录本的平均浓度分别为 1.19× 10 6和 2 .4 0× 10 5拷贝 /ml,2组测定值差异有显著性 (P <0 .0 1)。RLS法检测 5 3例中 13例为CEAmRNA阳性 ,阳性率为 2 4 .5 % ;FICOLL法检测到 5例阳性 ,阳性率 9.4 % ,RLS法的阳性检出率高于FICOLL法 (P <0 .0 5 )。结论　RLS法分离外周血有核细胞的效果优于FICOLL法 ,有利于提高基因表达检测的灵敏度。     

ABO血型A201等位基因表达A抗原活性的分析

目的研究ABO血型A201等位基因表达A抗原活性。方法运用血型血清学方法对1家2代3人的唾液及血液标本的ABO血型进行检测;运用Identifiler法医基因分析试剂盒作为亲缘关系鉴定;PCR扩增ABO基因后,对所有外显子做DNA测序分析,运用PCR-RFLP法进行同步检测A201等位基因中的序列变异。结果亲缘关系鉴定在Identifiler的15个遗传标记系统中显示,父母可以将所有的等位基因提供给子女,确定具有亲缘关系;然而运用不同来源的3份抗体对ABO血型进行检验时,却出现了正定型否定了母子关系,反定型无法排除母子关系的现象。3个标本ABO基因的测序:父、母、子的基因型分别为O01/O01、A201/B101及A201/O01,符合反定型结果,这就说明A201等位基因在A表型及AB表型中表达的A抗原活性差异显著。运用PCR-RFLP法可将A201等位基因中的2个主要变异点1059-1061del C和467C/T。结论 ABO血型A201基因在AB及A表型中表达A抗原活性,可由于检测抗体不同出现一定的差异;基因测序与PCR-RFLP法进行同步分析能够快速简便的鉴定A201等位基因中的1059-1061del C和467C/T。     

VEGF 在妊娠期糖尿病产妇分娩新生儿脐血中的表达研究

目的：探讨 VEGF 在妊娠期糖尿病产妇分娩新生儿的脐静脉血及动脉血中的表达及价值。方法对80例妊娠期糖尿病产妇分娩的新生儿及80例健康产妇分娩的新生儿的脐静脉和动脉血的 VEGF 水平进行放射免疫分析检测。结果观察组新生儿的脐动脉血 VEGF 水平为（24．06±8．79）pg/mL,脐静脉血 VEGF 水平为（20．69±7．78）pg/mL,均显著高于对照组;同时,观察组低血糖新生儿脐动脉血的 VEGF 水平显著高于对照组及观察组血糖正常的新生儿。结论妊娠期糖尿病产妇分娩新生儿的脐静脉和动脉血的 VEGF 水平明显高于健康产妇分娩的新生儿,新生儿脐动脉血的 VEGF 水平可以在一定程度上反映出妊娠期糖尿病对于胎儿的影响。     

电针对MCAO大鼠脑皮质EPO表达和脑血流量的影响

目的：观察电针疗法对局灶性脑缺血大鼠脑皮层EPO表达和缺血局部组织血流量的影响,探讨其作用机制.方法：SD大鼠80只,随机分为正常组和假手术组各10只、模型组和电针组各30只;模型组和电针组又各按缺血再灌注24h、48h和72h分别分为3个亚组,每组10只.假手术组仅分离血管而不插线栓,模型组和电针组制备大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）,电针组采用电针治疗.采用免疫组化组法及免疫印迹法检测大鼠脑皮质中促红细胞生成素（EPO）蛋白的表达,用激光多谱勒血流仪检测大鼠脑组织血流量（rCBF）的变化.结果：EPO免疫组化及Western结果比较,模型组及电针组EPO阳性细胞及蛋白表达均在脑缺血再灌注24h开始增加,48h达到峰值,72h开始下降,且电针组在3个时间点均高于同时间点模型组（P＜0.05,0.01）.rCBF比较,模型组和电针组随着24、48、72h 3个时间点呈明显增加趋势,且电针组各时间点rCBF均较模型组明显升高（P＜0.05,0.01）.结论：电针能使脑缺血再灌注脑组织中EPO表达增加,明显提高局部脑组织血流量,有助于减轻脑缺血再灌注后脑组织损伤.     

重症脓毒症患者外周血单核细胞膜结合CD14受体的表达与预后关系

目的 观察重症脓毒症患者外周血单核细胞(PBMC)膜结合CD14受体(mCD14)的表达变化与预后的关系.方法 选取35例重症脓毒症患者和15例健康志愿者作为对照.按预后分为生存组(25例)和死亡组(10例),用流式细胞仪检测PBMC表面mCD14表达在病后不同时间的动态改变.结果 生存组和死亡组发病后0小时急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ(APACHE-Ⅱ)、全身性感染相关器官功能衰竭评分(SOFA)分别为SOFA(18.93±9.37)分vs(20.75±8.6)分、SOFA(9.27±3.90)分vs(9.10±3.21)分(P>0.05),发病后0、12、24和48小时PBMC表面mCD14表达2.61±1.59、2.93±1.92、3.05±1.73、4.14±1.99显著低于正常对照组5.64±1.79(P<0.01),48和72小时逐渐升高4.14±1.99、4.51±2.08.但未达到正常对照水平(P<0.05).生存组与死亡组0、12、24、48和72小时mCD14表达3.14±1.95 vs 2.66±1.50、3.11±2.03 vs 3.45±2.01、3.66±1.87 vs 2.84±1.70、5.30±1.95vs 3.51±1.55,第48～72小时生存组明显高于死亡组,组间(F=15.969,P<0.01),不同时点(F=17.347.P<0.01),组间·不同时点(F=29.138,P<0.01)之间差异均有统计学意义.结论 重症脓毒症患者外周血单核细胞mCD14表达与患者预后密切相关,动态监测其改变对重症脓毒症的转归有一定的预警意义.     

肝癌患者外周血单个核细胞HLA-G表达研究

目的了解肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMC）人类白细胞抗原G（HLA—G）的表达水平。方法收集38例HCC患者、25例肝硬化患者和40名健康查体者的PBMC,分别用逆转录一聚合酶链反应（PCR）和流式细胞术（FCM）检测其HLA—GmRNA和HLA—G蛋白表达水平。结果HCC组、肝硬化组和健康对照组PBMCHLA—GmRNA表达率分别为94．7％、84．0％和87．5％,差异无统计学意义（P=0．359）;HCC组HLA—G蛋白表达率高于肝硬化组和健康对照组,差异有统计学意义（P=0．002）。HCC组PBMCHLA—G蛋白主要表达于CD4^＋细胞上。结论HCC患者PBMCHLA—G蛋白表达率升高,其机制与临床意义尚待进一步研究。