人全长survivin基因修饰树突状细胞疫苗抑制喉癌作用的体内外研究

,疫苗对体外细胞杀伤率51.5%,与对照组比较差异有统计学意义(t=7.1358,P＜0.01);对移植瘤细胞凋亡率为54.9%,坏死率为21.9%,分别与对照组比较,差异有统计学意义(t值分别为33.0209和17.5057,P＜0.01).结论 经人全长survivin基因修饰后,DCs表面分子的表达率较未经基因修饰DCs显著增高,具有更强刺激T淋巴细胞增殖,促进γ干扰素,在体内外具有促进杀伤喉癌细胞的能力.     

人全长survivin基因修饰树突状细胞疫苗抑制喉癌作用的体内外研究

proliferation, and promote secretion of γ-IFN; in vivo, in vitro to promote the ability of anti-laryngeal cancer cells.     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

白藜芦醇抑制喉癌Hep-2细胞系的生长

目的:研究白藜芦醇对喉癌细胞系Hep-2细胞生长的抑制作用。方法:在显微镜下计算细胞密度,MTT法绘制细胞生长曲线并计算细胞生长抑制率,利用软琼脂集落形成实验在倒置纤维镜下观察白藜芦醇处理Hep-2细胞前后细胞形态学变化及计算集落形成率。结果:各浓度的白藜芦醇均可使细胞生长曲线降低,细胞倍增时间延长。白藜芦醇也可以明显抑制Hep-2细胞形成集落,并发现白藜芦醇对细胞形态的影响与药物的剂量有明显的关系。结论:白藜芦醇对喉癌细胞系Hep-2细胞生长的抑制具有时间和剂量依赖性。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的：研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．CDglyTK,XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg／LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT—PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1（-）的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果：酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论：CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用及其对端粒酶活性的影响

目的 研究丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用及诱导凋亡过程中对端粒酶活性的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl terazolium,MTT)比色法观察不同浓度丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制作用,透射电镜下观察其形态学变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling,TUNEL)法、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测丁酸钠作用后的细胞凋亡情况及细胞周期变化,端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)-银染法检测端粒酶活性变化,RT-PCR分析端粒酶各组分的mRNA表达情况.结果 丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性.透射电镜下可见典型的凋亡细胞形态学改变.琼脂糖凝胶电泳可见特征性的凋亡细胞DNA梯状条带.TUNEL法显示,2.5 mmol/L丁酸钠作用72 h,细胞凋亡指数由作用前的2.27±1.18增加至33.50±2.75.流式细胞仪显示,2.5 mmol/L丁酸钠作用72 h,细胞凋亡率由作用前的2.86%增加至31.28%,G0/G1期细胞比例由50.38%增加至70.88%,S期细胞比例由27.40%减少至8.20%,细胞增殖指数由49.62%降低至29.12%.TRAP-银染法显示,丁酸钠作用后细胞端粒酶活性下降,且具有一定时间效应关系.RT-PCR显示端粒酶逆转录酶表达下降而端粒酶RNA模板和端粒酶相关蛋白表达无明显改变.结论 丁酸钠对Hep-2细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用,并可能通过下调端粒酶逆转录酶表达而抑制端粒酶活性.     

紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用研究

目的：通过体外实验评价紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用。方法：应用人喉癌细胞系Hep-2，将细胞暴露于不同浓度紫杉醇下，分别于6、12、24、48、72h收集标本，进行细胞形态观察；流式细胞仪细胞周期分析；MTT法检测细胞生长情况，绘制细胞生长曲线；应用琼脂糖凝胶电泳进行检测和观察。结果：人喉癌细胞系Hep-2在紫杉醇的作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡；凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质凝聚或者断裂；细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带；紫杉醇对Hep-2的细胞毒性与剂量和时间有依赖关系。结论：紫杉醇诱发人喉癌细胞凋亡与细胞分裂期阻滞密切相关，随浓度和时间延长，G2／M期细胞的比率也增高。     

吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的生长及侵袭作用的研究

目的：通过体外实验评价吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的抑制作用。方法：应用不同浓度的吲哚美辛作用于人喉癌Hep-2细胞系，进行细胞形态观察，锥虫蓝染色法检测细胞生长情况和流式细胞仪分析细胞DNA含量。Hep-2细胞经吲哚美辛作用后，撤药培养，绘制生长曲线，并用软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞非锚着生长能力，琼脂糖滴法检测肿瘤细胞移动能力，单层细胞侵袭实验计算肿瘤侵袭指数。结果：Hep-2细胞系在吲哚美辛作用下，细胞生长形态改变，细胞增殖缓慢，流式细胞仪分析形成明显的亚二倍体峰。细胞毒性与药物剂量及作用时间有依赖关系。吲哚美辛作用后的Hep-2细胞软琼脂集落形成数目减少，细胞移动能力下降，单层细胞侵袭指数降低，但生长曲线较对照组无明显差异。结论：吲哚美辛抑制人喉癌细胞系Hep-2生长，诱导凋亡，降低细胞的侵袭性。     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.     

靶向人端粒酶小干扰RNA对人喉癌Hep-2细胞系形态学影响

目的 探讨靶向人端粒酶基因siRNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞形态学的影响。方法 根据人端粒酶基因设计和合成人端粒酶siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep 2细胞,观察形态学结构。结果 转染siRNA 48?h后细胞皱缩、变圆并开始脱落。HE染色显示细胞呈明显的良性转化。透射电镜下可见细胞凋亡、胀亡的形态改变。结论 靶向人端粒酶基因的siRNA能促使Hep-2细胞形态呈良性转化,并能促进肿瘤细胞凋亡。     

Caveolin-1对喉鳞状细胞癌抑制作用的体内外研究

目的探讨caveolin-1对喉鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞生长的影响。方法通过脂质体法转染喉鳞癌细胞株Hep-2细胞，筛选出稳定高表达caveolin-1的克隆，并用实时定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定；用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的体外增殖能力；免疫印迹法检测细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷酸化EGFR、细胞外信号调节激酶1、2（extracellular signal-regulated kinase，Erk1、2）、磷酸化Erk1、2，caveolin-1蛋白的表达；免疫共沉淀法检测caveolin-1和EGFR的结合情况；转染后的细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤的生长情况，裸鼠移植瘤中caveolin-1、磷酸化EGFR、磷酸化Erk1、2的蛋白表达用免疫组织化学法检测。结果成功筛选到稳定高表达caveolin-1的克隆；与对照组相比，转染后的细胞体外增殖能力明显减弱；细胞接种到裸鼠皮下，未转染组和转染空载组中裸鼠均形成肿瘤（100％，4／4），稳定转染caveolin-1的Hep-2-CAV1-2组中裸鼠未形成实体肿瘤（0％，0／4），Hep-2-CAVl-3组中4只裸鼠中只有3只形成肿瘤（75％，3／4），但肿瘤生长缓慢，最终生成肿瘤的重量与未转染组相比明显减小（t=3．05，P〈0．05）；免疫共沉淀显示caveolin-1与EGFR在Hep-2细胞中是结合的；免疫印迹法和免疫组织化学法发现转染caveolin-1后细胞中EGFR和Erk1、2的磷酸化水平降低。结论caveolin-1能够抑制喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的生长，抑制EGFR-MAPK信号通路可能与其抑癌作用相关。