Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

siRNA下调β-catenin基因对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响CSCD

目的应用siRNA干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2细胞中的表达,探讨下调β-catenin基因后对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 RNA干扰技术干扰喉癌Hep-2细胞β-catenin基因的表达,实时荧光定量PCR和Western-blot方法进行干扰效果鉴定;采用MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪AnnexinPI法检测细胞凋亡率、transwell法观察细胞的迁移侵袭能力。结果实时荧光定量PCR检测表明β-catenin-siRNA干扰组mRNA相对表达量较空白对照组下降达70%,Western blot结果显示干扰组β-catenin蛋白相对表达量为(0.545±0.111),较空白对照组(1.507±0.139)和阴性对照组(1.429±0.089)明显下降(F=21.859,P<0.05)。细胞增殖实验证实靶向干扰β-catenin表达导致喉癌细胞增殖明显受抑制。流式细胞仪AnnexinPI法检测说明,β-catenin-siRNA干扰组凋亡率(18.80±0.81)%与空白对照组(8.6±0.68)%和阴性对照组(9.03±0.26)%相比明显增加(F=253.93,P<0.01)。Transwell侵袭实验表明β-catenin-siRNA干扰组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较空白对照组和阴性对照组均明显减少(F=136.20,P<0.01)。结论干扰β-catenin基因在喉癌Hep-2中的表达可抑制喉癌Hep-2细胞的增殖和侵袭能力,促进喉癌Hep-2细胞的凋亡。     

丙戊酸钠对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及机制的研究

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)对体外培养的人喉癌Hep-2细胞凋亡的影响及其机制。方法:不同浓度VPA处理人喉癌Hep-2细胞不同时间后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测凋亡率,RT-PCR检测凋亡抑制蛋白Survivin mRNA表达的变化。结果:VPA对人喉癌Hep-2细胞的生长具有明显的增殖抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测发现:以3 mmol/L的VPA处理Hep-2细胞后,其凋亡率呈时间依赖性上升(P<0.01)。RT-PCR检测发现人喉癌Hep-2细胞Survivin mRNA表达呈时间依赖性下调(P<0.01)。结论:VPA对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,其作用机制与下调Survivin表达比例有关。     

抑制水通道蛋白1对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察水通道蛋白1(AQP-1)对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学SABC方法多种技术分别检测AQP-1的抑制剂乙酰唑胺对细胞生长抑制率、凋亡率和细胞内AQP-1蛋白表达的影响。结果:乙酰唑胺在5×10-5mol/L浓度下对Hep-2细胞内AQP-1蛋白表达有明显的抑制作用,细胞生长抑制率和细胞凋亡率均随时间延长而增大,呈时间依赖性。并且TUNEL法检测的细胞凋亡率与免疫组织化学SABC方法检测的AQP-1蛋白抑制率呈明显正相关(r=0.784,P<0.05)。结论:乙酰唑胺在一定浓度下对AQP-1的抑制可显著诱导喉癌Hep-2细胞凋亡,提示AQP-1可能成为治疗喉癌新的靶点。     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验

目的：探讨靶向抑制survivin表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响。方法：构建survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418（300g／L的维持浓度）筛选,获得稳定转染株（HpEGFP／survivin）。用Western-blot检测survivin反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果。吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐（MTT）和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP／surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞（HpEGFP-C1）进行比较。结果：Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2 survivin蛋白的表达。转染反义survivin RNA载体的HpEGFP／survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1．81倍,而其增殖力下降（P〈0．01）,软琼脂集落形成能力也明显下降（Pd0．05）。结论：构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力。     

靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

喉癌细胞诱导活性T淋巴细胞凋亡的机制探讨

目的:观察人喉癌Hep-2细胞Fas和FasL的表达,探讨Fas/FasL途径在人喉癌细胞免疫逃避中的作用.方法:应用RT-PCR、流式细胞仪检测Hep-2细胞表面Fas/FasL的mRNA及蛋白表达;Hep-2细胞与Jurkat细胞共培养,MTT比色法描绘Jurkat细胞生长曲线,应用流式细胞术及Hoechst染色荧光显微镜观察及检测Jurkat细胞凋亡.结果:流式细胞仪检测Hep-2细胞表面Fas及FasL表达的平均荧光强度分别为32/91±5.6和25.57±7.1.Hep-2细胞(密度为1×109/L)分别与Jurkat细胞(密度为1×108/L、5×108/L)共培养24 h,流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡率为(38.95±0.11)%和(13.28±0.14)%.而Jurkat细胞单独培养的凋亡率为(7.53±0.17)%.MTT比色法检测显示共培养后Jurkat细胞生长受到明显抑制;当共培养体系中加入FasL中和性抗体后,Jurkat细胞凋亡率显著下降(P<0.01).结论:人喉癌细胞株Hep-2表面表达的FasL通过诱导活化T淋巴细胞Jurkat细胞产生凋亡而使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视.     

靶向血小板衍生生长因子-B siRNA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的探讨血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)B链mRNA的siRNA质粒转染喉癌细胞株Hep-2细胞,沉默Hep-2细胞中PDGF-B mRNA并检测细胞增殖。方法以脂质体lip2 0 0 0为载体,设计4组针对PDGF-B的siRNA片段瞬时转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR、Westernblot分别检测各组PDGF-B mRNA、PDGF-B蛋白的表达及干扰效果,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,并与阴性对照组和空脂质体组进行比较。结果实时荧光定量PCR检测显示:SiRNA2、SiRNA3、SiRNA4组PDGF-B mRNA表达均有明显抑制,其中SiRNA2抑制率最高;与SiRNA1、阴性对照组及空脂质体组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3组PDGF-B mRNA蛋白表达均有下降,其中SiRNA-2下降最明显,而SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组对PDGF-B蛋白表达无明显抑制作用。MTT法检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3均明显抑制Hep-2细胞增殖,其中SiRNA-2对Hep-2细胞的抑制作用最明显;且与SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功运用siRNA干扰喉癌Hep-2细胞PDGF-B mR-NA,靶向沉默PDGF-B mRNA能有效抑制细胞增殖。     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

选择性环氧化酶-2抑制剂对Hep-2细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

目的研究选择性环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂尼美舒利对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)裸鼠移植瘤血管生成的影响,并探讨其相关作用机制。方法建立Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,实验组予以尼美舒利腹腔注射治疗,对照组腹腔等量注射生理盐水,4周后处死裸鼠并取肿瘤组织,利用免疫组化染色法检测移植瘤组织中CD31表达,并计算微血管密度(microvessel density,MVD),利用RT-PCR和免疫组化染色法分别检测移植瘤组织中COX-2、血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)、碱性成纤维生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)mRNA和蛋白的表达,比较分析实验组与对照组MVD及COX-2、Ang-2、bFGF表达差异。结果实验组MVD值为12.83±3.06,明显低于对照组25.50±4.85,实验组移植瘤组织中COX-2、Ang-2、bFGF的mRNA和蛋白水平与对照组相比明显降低,且MVD与COX-2、Ang-2、bFGF蛋白表达水平关系密切。结论尼美舒利能有效抑制Hep-2细胞裸鼠移植瘤血管生成,其机制可能与抑制Ang-2、bFGF直接产生抗血管生成作用以及减少COX-2表达有关。     

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的 研究凋亡抑制蛋白Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的表达,探讨其在喉癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组织化学技术,研究42例喉癌标本、20例癌旁组织、20例喉角化症、10例正常喉黏膜中Survivin 蛋白的表达情况;并用RT-PCR技术检测喉癌细胞株Hep-2中Survivin mRNA的表达。结果 正常喉黏膜中无Survivin表达, 喉癌组织中Survivin 蛋白的表达 (66.6 %) 明显高于癌旁组织 (40.0 %)和喉角化症(35.0 %)(P<0.001),喉癌组织中Survivin表达与临床分期、病理分级及有无颈淋巴结转移无明显相关性(P > 0.05)。喉癌细胞株Hep - 2中有较强Survivin mRNA的表达。结论 Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的高表达可能与喉癌的发生关系密切,具体机制有待于进一步研究。     

TNFRⅡ转基因诱导喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor 2,TNFRⅡ）转基因结合TNFα局部注射诱导喉鳞状细胞癌裸鼠模型肿瘤细胞的凋亡和杀伤肿瘤的效果,为喉鳞状细胞癌的基因治疗开辟新途径。方法：在利用人喉鳞状细胞癌Hep2细胞建立人喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型的基础上,以脂质体为载体采用体内转基因技术,活体转染人类TNFRⅡ并联合局部TNF-α注射,采用肿瘤大体观察、流式细胞术、免疫组织化学、TuneⅠ、透射电镜等方法观察TNFRⅡ转染前后肿瘤细胞TNFRⅡ表达水平、肿瘤细胞凋亡情况,综合评价对肿瘤杀伤和抑制的效果。结果：裸鼠喉癌移植瘤模型的成瘤率为94．5％。活体转基因48h TNFRⅡ表达水平达最高峰并在72h内维持较高水平。免疫组织化学方法证实TNFRⅡ主要表达在肿瘤细胞的细胞膜上,空质粒转染组肿瘤细胞几乎无TNFRⅡ表达。2000U TNFα局部注射对肿瘤的诱导凋亡和杀伤的抑制效率最高,表现为在TNFRlI转基因组动物治疗结束时肿瘤的体积为（1161．333±166．555）mm^3,瘤体重量为（1．100±0．832）g,瘤／鼠重为0．044±0．332,凋亡率为（38．226±13．671）％,与空质粒转染对照组相比具有明显差别。Tunel和超微结构观察发现前者的细胞凋亡明显高于后者。结论：通过TNFRⅡ活体转基因提高其蛋白表达水平可以明显提高TNFα局部注射杀伤喉癌移植瘤模型动物肿瘤细胞的效果,其机制是通过更有效诱导细胞凋亡来实现的。活体TNFRⅡ转基因结合TNFα局部注射有可能成为喉癌基因治疗的一个有效方法。