反义端粒酶基因表达抑制人癌细胞恶性表型

目的 观察端粒酶基因ｈＴＲＴ,ｈＴＲ反义表达对癌细胞生物学行为的影响,探讨改变端粒酶基因表达在肿瘤治疗中的作用。方法 通过反义ｈＴＲＴ基因转染人ＨｅＬａ细胞系,反义ｈＴＲ寡核苷酸处理人肺巨细胞癌系ＰＧ,观察其对肿瘤细胞生长及恶性表型的影响。     

反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致。而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。     

Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨Bcl-XL反义寡核苷酸转染后,对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。方法采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸转染、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western蛋白印迹杂交、四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)、流式细胞术及凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测等方法观察了Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响。结果MTT法检测显示,Bcl-XL反义寡核苷酸可显著抑制食管癌细胞的增殖(P<0.05);对Bcl-XLmRNA表达抑制率为57.3%,可显著下调Bcl-XL的蛋白表达;应用流式细胞术和TUNEL检测技术,反义寡核苷酸组的凋亡率分别为(31.1±5.8)%和35.0%,与相关对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。反义寡核苷酸组裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长受到显著抑制(P<0.05)。Bcl-XLmRNA及蛋白表达亦受到明显抑制,并且移植瘤组织中凋亡细胞明显增加。结论Bcl-XL反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长。通过反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达,达到治疗食管癌的目的,为食管癌的基因治疗提供实验依据。     

可调控型反义基质金属蛋白酶9表达抑制人黑色素瘤细胞侵袭转移表型的研究

目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-9与肿瘤转移的相关性。方法 利用基因重组技术构建反义MMP—9 cDNA四环素可调控型表达载体,用脂质体法转染反义MMP—9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP—9)。检测转染后细胞MMP—9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 转染反义基因后,WM451细胞MMP—9的表达及活性明显下降,同时MMP—2的表达也受到一定抑制,细胞生长速度、体外侵袭能力及棵鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论 反义MMP—9基因下调MMP—9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP—9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

聚酰胺-胺型树枝状高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸抑制人肝癌裸鼠 移植瘤生长的作用*☆

背景：采用反义寡核苷酸等治疗方法可以抑制凋亡抑制因子Survivin 的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。目前使用Survivin治疗恶性肿瘤仍存在基因载体转染效率低下、不能长期稳定表达、易被酶降解等难题。 目的：观察聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)脂质体介导Survivin-反义寡核苷酸对人肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。 方法：以人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下注射建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将PAMAM脂质体和PAMAM分别与Survivin-反义寡核苷酸混合得到载反义基因转染复合物。测定复合物的zeta电位及包封率。将两种载基因复合物注射道裸鼠移植瘤体内,观察两组移植瘤大小,检测移植瘤组织中survivin基因的表达。 结果与结论：PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物的zeta电位高于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物(P < 0.05),基因包封率两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物治疗组裸鼠移植瘤质量及survivin蛋白表达低于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物组(P < 0.05)。提示PAMAM脂质体能将Survivin-反义寡核苷酸高效递送到人肝癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,诱导移植瘤细胞凋亡。 关键词：聚酰胺-胺型树枝状高聚合物;脂质体;肝癌;反义寡核苷酸;Survivin doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.020      

四元复合体介导C-MYC反义RNA抑制肝癌细胞生长增殖

目的探讨四元复合体介导的C-MYC反义RNA转移系统对肝癌细胞系HepG2.2.15致瘤性的体内外抑制作用。方法C-MYC反义RNA四元复合体体外瞬时转染HepG2.2.15细胞,流式细胞术检测C-MYC蛋白的表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化,MTT法测定细胞增殖代谢活性。以HepG2.2.15细胞制备荷瘤裸鼠模型,局部瘤内注射C-MYC反义RNA四元复合体或联合注射IFN-α,称量瘤重,免疫组化方法检测肿瘤组织C-MYC蛋白的表达。结果C-MYC反义RNA可显著降低细胞C-MYC蛋白的表达水平,使细胞生长停滞于G0/G1期。体内抑瘤实验显示,反义治疗组瘤体C-MYC蛋白表达降低,瘤重(1.72±0.16)g,显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。联合IFN-α注射组抑瘤效果更佳。结论肿瘤组织靶向性C-MYC反义RNA转移系统在体内外均可有效降低C-MYC蛋白的表达,抑制细胞的生长增殖。体内联合IFN-α可取得更佳的抑瘤效果。     

脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1的表达

目的 探讨l 0- 23脱氧核酶(1 0-23DR z)对鼻咽癌生长的抑制作用。 方法 设计合成针对EBV-LMP1的l0-23DRz，并对其进行硫代磷酸化修饰，同时针对该位点设计突变型DR z和反义寡核苷酸，经脂质体转染C666-1细胞中观察其对LMP1基因表达的抑制效应；建立裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤，瘤体内注射脱氧核酶及其类似物，观察其对LMP1基因及肿瘤生长的抑制效应。 结果 有效转染后，脱氧核酶在细胞内抑制LMP1基因表达；成功建立裸鼠移植瘤模型后，脱氧核酶能高效抑制LMP1基因表达，并能抑制肿瘤生长，其作用较突变型脱氧核酶和反义寡核苷酸强（P<0.05）。 结论 脱氧核酶在鼻咽癌细胞中及移植瘤模型中都能高效抑制LMP1的表达，可能成为一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。     

VEGF165反义RNA对人食管鳞癌细胞影响的实验研究

目的 :观察血管内皮生长因子16 5 (VEGF16 5 )反义RNA对人食管鳞癌细胞EC10 9的影响 ,探讨其治疗食管癌的可行性。方法 :采用亚克隆技术 ,构建并鉴定VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体。以重组质粒转染人食管鳞癌细胞EC10 9后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,分别利用原位杂交、激光共聚焦、图象分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后EC10 9细胞的生物学性状和致瘤性。结果 :成功地构建了VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体 ,并在EC10 9细胞中获得表达。转染细胞中VEGF16 5 的表达下降 75% ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和和瘤组织中血管的生成明显下降。VEGF16 5 反义RNA转染组、空载体转染组和对照组中肿瘤的体积 ,分别为 (82 0± 112 .5)mm3 、(793 0± 10 3 5)mm3 和 (7850± 950 )mm3(P <0 .0 1) ;微血管的密度分别为 (8.5± 1.2 ) /mm2 、(44.3± 9.4) /mm2 和 (46.4± 12 .6) /mm2 (P <0 .0 1)。结论 :VEGF16 5反义RNA能够明显减少食管鳞癌细胞内VEGF16 5 的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,可望用于实体肿瘤的辅助治疗。     

肿瘤细胞的致瘤性与染色体及基因变化的关系

人肿瘤细胞的裸鼠致瘤性试验是肿瘤生物学特性观察的一项重要指标,肿瘤细胞致瘤性变化的主要决定因素是染色体、基因的结构和功能变化。其中肿瘤抑制基因的缺失或癌基因的扩增与肿瘤细胞的致瘤性关系密切。将肿瘤抑制基因转染入相应的肿瘤细胞可降低肿瘤细胞的致瘤性,而转染癌基因或原癌基因可增强肿瘤细胞的致瘤性或使无致瘤性的细胞获得了致瘤性。肿瘤细胞系在体外传代或裸鼠体内传代过程中,可发生染色体、基因的改变,通过筛选可获得具不同生物学特性的亚细胞系。     

肿瘤细胞的致瘤性与染色体及基因变化的关系

人肿瘤细胞的裸鼠致瘤性试验是肿瘤生物学特性观察的一项重要指标 ,肿瘤细胞致瘤性变化的主要决定因素是染色体、基因的结构和功能变化。其中肿瘤抑制基因的缺失或癌基因的扩增与肿瘤细胞的致瘤性关系密切。将肿瘤抑制基因转染入相应的肿瘤细胞可降低肿瘤细胞的致瘤性 ,而转染癌基因或原癌基因可增强肿瘤细胞的致瘤性或使无致瘤性的细胞获得了致瘤性。肿瘤细胞系在体外传代或裸鼠体内传代过程中 ,可发生染色体、基因的改变 ,通过筛选可获得具不同生物学特性的亚细胞系。     

白藜芦醇诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的研究

目的：探讨白藜芦醇诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的机制。 方法： 建立人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤模型，采用瘤旁注射的方法，用不同剂量的白藜芦醇进行治疗，并设对照，用透射电镜和TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况，免疫组织化学法和RT-PCR法检测肿瘤组织的凋亡相关基因bcl-2和bax的表达情况。 结果： 白藜芦醇对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用； 透射电镜和TUNEL法发现白藜芦醇导致移植瘤内大量细胞发生凋亡；免疫组织化学法发现白藜芦醇注射组的Bcl-2蛋白阳性细胞率（3.92％±0.85％、5.70％±0.84％和11.86％±0.97％）明显低于两个对照组（P<0.05），两个对照组（27.56％±1.40％和29.48％±0.51％）之间无显著差异；Bax蛋白阳性细胞率（52.30％±1.54％、45.72％±0.88％和40.02％±1.20％）明显高于两个对照组（P<0.05），两个对照组（20.88％±0.91％和19.34％±0.35％）之间无显著差异； RT-PCR法发现白藜芦醇注射组的bcl-2 mRNA条带强度随剂量的增大而递减，并明显低于两个对照组（P<0.05），两个对照组之间无显著差异（P>0.05）；bax mRNA条带强度递增，并明显高于两个对照组（P<0.05），两个对照组之间无显著差异（P>0.05）。 结论： 白藜芦醇对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用，通过下调bcl-2 的表达和上调bax 的表达而诱导胃癌裸鼠移植瘤细胞发生凋亡，是其抗胃癌作用的机制之一。     

IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响

目的:分析转染IL-18基因后,对小鼠卵巢癌OVHM细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法:将逆转录病毒携带的小鼠IL-18基因成功转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型(OVHM)作为对照.分别采用MTT、FCM检测体外培养细胞的增殖、凋亡及周期分布.于裸鼠皮下分别接种细胞,观察各组种植瘤生长情况,计算成瘤率;RT-PCR检测瘤组织中IL-18 mRNA表达;FCM和电镜分析肿瘤细胞增殖、凋亡状况.结果:3组细胞的体外增殖未见明显差异,均无明显凋亡现象,增殖指数、细胞周期分布均无明显差异(均P>0.05).接种后,3组裸鼠的成瘤率相同,但OVHM/IL-18组成瘤时间较晚,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢,瘤组织中IL-18 mRNA阳性表达.OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,增殖指数明显降低,凋亡指数明显增高(P<0.01).结论:IL-18基因成功转染后,虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性,但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径,通过阻断细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤.     

反义VEGF165基因转染抑制裸鼠体内人神经母细胞瘤的生长

目的研究反义VEGF165cDNA转染对裸鼠移植性人神经母细胞瘤血管生成及超微结构的影响。方法将稳定转染正义VEGF165cDNA、反义VEGF165cDNA及空载体的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y接种于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;HE染色观察肿瘤组织病理变化;透射电镜观察肿瘤组织超微结构;免疫组化染色比较裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果与空载体组相比,反义组裸鼠肿瘤瘤块体积小(P<0.05),MVD显著减少(P<0.01),肿瘤组织内血管稀疏,核分裂相少见,内皮细胞变性、肿胀,血液淤滞,凋亡细胞多见。结论反义VEGF165cDNA转染能抑制裸鼠人神经母细胞瘤的生长,降低瘤块内微血管生成,促使肿瘤细胞凋亡。     

介导RA538与反义c-myc腺病毒对肿瘤细胞的作用及其分子机理

目的　比较全反式维甲酸诱导基因 RA5 38及反义 c- myc对人胃癌细胞的生物学特性 ,并探讨其作用的分子机理。方法　采用细胞生长曲线、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、逆转录 -聚合酶链反应、蛋白质印迹分析、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法 ,对 RA5 38、反义 c- myc重组腺病毒在人胃癌细胞系 (SGC790 1)中的生物学作用及其分子机理进行体内外研究。结果　 RA5 38及反义 c- myc重组体腺病毒 (Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc)对 SGC790 1细胞生长抑制率分别为 76 .3%和 44 .1%。 DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc诱导 SGC790 1细胞凋亡。它们均能抑制SGC790 1细胞 c- myc、bcl- 2、cyclin D1基因表达 ,并刺激 bax基因表达 ,对 p5 3、p16、TGase、ras基因的表达没有影响。经 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc处理的 SGC790 1细胞致瘤性消失。Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度 ,生长抑制率分别为 6 0 .7%和 6 8.9%。结论　 Ad-RA5 38、Ad- ASc- myc对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用是 c- myc、bcl- 2、bax、cyclin D1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果 ,与 p5 3、p16、TGa     

反义人IL-10和反义病毒性IL-10抗鼻咽癌细胞成瘤效应的研究

目的:探讨反义人IL-10和反义病毒性IL-10抑制鼻咽癌细胞成瘤的效果。方法:扩增及克隆hIL-10 cDNA和 vIL-10基因,构建反义hIL-10和反义vIL-10双价真核表达载体pcDNA3/AS hIL-10 AS vIL-10,转染鼻咽癌细胞株SUNE。将转染阳性的SUNE细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种SCID小鼠和经健康人外周血白细胞免疫重建的SCID小鼠（hu-PBL-SCID鼠）,观察成瘤效应。结果:ELISA法测得未转染SUNE细胞培养上清液中IL-10和vIL-10的总含量为242±23pg/ml,而转染阳性的SUNE细胞培养上清液中hIL-10和vIL-10的总含量仅为22±6pg/ml。在SCID鼠体内,vIL-10和hIL-10的表达与否,并不影响鼻咽癌细胞的成瘤活性,但在hu-PBL-SCID鼠体内,抑制vIL-10和hIL-10的表达则可明显抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用。结论:反义人IL-10和反义病毒性IL-10可显著抑制鼻咽癌细胞在血hu-PBL-SCID鼠体内的成瘤作用,鼻咽癌组织表达vIL-10和hIL-10的确与鼻咽癌免疫耐受有关。     

血管内皮生长因子反义基因转染对高转移人巨细胞肺癌细胞系生 …

目的 探讨反义血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因转染在抑制恶性肿瘤生长和转移的抗肿瘤血管基因治疗中的意义。方法 利用基因重组技术构建正义和反义ＶＥＧＦ１２１ ｃＤＮＡ真核表达载体,用脂质体法转染高转移性人巨细胞肺癌细胞（ＰＧ）,经Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹免疫化学检测ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ和蛋白质的表达水平,并对转染前后细胞进行体外生长和裸鼠体内生长转移等多项生物学行为实验,结果 转染反义转     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.