碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景:已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。目的:构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法:通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+H2O2)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论:成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P<0.01),而bFGF转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P<0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

促红细胞生成素预防内皮细胞凋亡时对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3亚家族的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)在预防氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡过程中对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspases-3)亚家族的影响.方法 体外培养HUVECs,将细胞随机分组,分别加入caspase-3抑制剂DEVD-CHO、caspase-8抑制剂z-IETD-fmk、caspase-9抑制剂z-LEHD-fmk各25 μmol/L预孵育24 h后,再加入100 mg/L ox-LDL处理48 h.平行实验中,加入6.25、25.00、100.00 kU/L的rhEPO预处理HUVECs 24 h,再加入100 mg/L ox-LDL处理48 h.用比色法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9活性;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HUVECs活性;用流式细胞术检测caspase-3阳性表达率和HUVECs凋亡率.结果 caspase-3抑制剂、caspase-8抑制剂分别降低各自对应的caspase活性,caspase-9抑制剂可同时降低caspase-3、caspase-9活性(P均<0.05).加入rhEPO预处理后,ox-LDL诱导内皮细胞caspase-3、caspase-9活性及caspase-3阳性表达率降低,且呈剂量依赖性(P均<0.05),而caspase-8活性无明显变化,HUVECs的细胞凋亡率也呈剂量依赖性降低(P均<0.05).结论 rhEPO可呈剂量依赖性抑制ox-LDL诱导HUVECs 凋亡时caspase-3、caspase-9活性,提示ox-LDL诱导HUVECs 凋亡信号通路涉及caspase-3、caspase-9,而与caspase-8无关.     

RNA干扰Caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用

目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.     

去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL-60凋亡

为了研究铁螯合剂-去铁胺（deferoxamine,DFO）诱导人白血病细胞株HL-60凋亡时半胱天冬酶-3（caspase-3）活性的变化并探讨DFO诱导凋亡的可能机制.HL-60细胞经HE染色,在光学显微镜下观察其形态结构变化,用TUNEL法和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡,免疫组织化学法检测caspase-3活性,原位杂交法检测凋亡基因bax的转录水平.结果表明,HL-60经去铁胺处理后,典型的细胞形态改变、DNA末端原位标记和FCM检测均证实DFO可诱导细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性.在DFO诱导HL-60凋亡过程中,caspase-3活性明显升高,凋亡基因bax的转录水平均较对照组增高（P＜0.05）.caspase广谱抑制剂Z-AVD可明显降低DFO诱导的细胞凋亡率.结论：DFO通过激活caspase-3和增强bax活性而诱导HL-60凋亡.     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

丹参酮IIA对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞组织因子表达的影响

目的：分析丹参的主要活性成分丹参酮IIA对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）组织因子（TF）表达的影响。方法将分离的HUVECs随机等分为空白对照组、凝血酶处理组及不同浓度丹参酮IIA处理组。其中凝血酶处理组加入凝血酶（终浓度5U/ml），不同浓度丹参酮IIA处理组加入凝血酶（终浓度5U/ml）和不同浓度的丹参酮IIA（终浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml和1.0μg/ml），空白对照组则加入等量的无血清培养基。各组HUVECs均在37℃培养6h后收集细胞。结果各组HUVECs孵育6h后，凝血酶处理组HUVECs中TF mRNA的转录明显强于空白对照组（P〈0.001），不同浓度的丹参酮IIA可不同程度抑制TF mRNA的转录，与凝血酶处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.001），且呈剂量依赖关系。HUVECs与凝血酶孵育后，所表达的TF促凝活性（TF：C）和抗原含量（TF：Ag）均明显增加，明显高于空白对照组（P〈0.001）。不同浓度的丹参酮IIA均可不同程度地抑制凝血酶所诱导的TF：C和TF：Ag表达（P〈0.001），且呈剂量依赖关系。结论丹参酮IIA可抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞TF基因的转录和表达，这可能是丹参酮IIA发挥抗血栓形成作用的重要机制。     

载基因壳聚糖纳米超声微泡转染miRNA诱导Hela细胞凋亡的研究

目的:探讨载Survivin-miRNA的壳聚糖纳米超声微泡对癌细胞凋亡、增殖的影响.方法:实验分为5组,空白对照组、壳聚糖纳米超声微泡组和低、中、高浓度载Survivin-miRNA的壳聚糖纳米超声微泡转染组(分别给予50、100和200 nmol/L miRNA转染).流式细胞术检测各组Hela细胞凋亡指数(AI)和增殖指数(PI),RT-PCR检测靶向Survivin和caspase-3的mRNA表达,荧光分光光度法分析caspase-3活性变化.结果:各浓度转染组细胞AI明显高于对照组(P＜0.05),高浓度转染率最明显(P＜0.05);各浓度miRNA转染组PI明显低于对照组(P＜0.05),高浓度转染组最明显(P＜0.05);各浓度miRNA转染组Survivin mRNA转录水平有不同程度减弱.Caspase-3 mRNA的表达在各组细胞间差异无显著性(P＞ 0.05);各转染组细胞caspase-3活化水平较对照组明显提高(P＜0.01).结论:不同浓度靶向Survivin基因的miRNA能下调Survivin的mRNA表达水平,对caspase-3 mRNA的表达无明显作用,能激活caspase-3无活性前体,从而诱导Hela细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

has-miR-203真核表达载体的构建及对K562细胞增殖与凋亡的影响

目的构建hsa-miR-203(人微小非编码RNA-203)的真核表达载体,观察其对人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)增殖和凋亡的作用。方法构建hsa-miR-203靶向基因的真核表达载体PmiR-203,用脂质体转染法将PmiR-203转染K562细胞;可溶性噻唑盐-8(WST-8)法检测转染后的K562细胞增殖的情况,流式细胞术检测转染后K562细胞的早期凋亡率,实时荧光定量RT-PCR检测bcr/abl mRNA的表达水平,比色法测定caspase-3、caspase-9的活性。结果本法成功构建了重组真核表达载体PmiR-203,流式细胞术结果表明,K562细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达率52.6%。PmiR-203转染K562细胞48 h后,能明显抑制K562细胞的增殖,并促进细胞的早期凋亡。实时荧光定量RT-PCR结果表明,不同浓度的PmiR-203能显著下调bcr/ablmRNA的表达水平,转染后K562细胞的caspase-3、caspase-9的活性明显增强。结论成功构建了hsa-miR-203的真核表达载体PmiR-203,后者主要通过下调bcr/abl融合基因的表达抑制K562细胞的增殖,并通过活化caspase-3、caspase-9促进K562细胞的早期凋亡。     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一,其对内皮细胞凋亡影响的报道不多.实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制.方法:实验于2006-12/2007-07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成.①实验材料及分组处理:取人新鲜脐带(产妇或家属签署知情同意书)分离培养人脐静脉内皮细胞,分为: 胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L) 胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L)组、正常对照组.分别在细胞培养24 h后加入.②实验评估:采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力;DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定;并进行内皮细胞 caspase-3活性的检测.结果:①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖,胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后,细胞增殖率明显上升(P ＜ 0.05).②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡,而加入胰岛素样生长因子Ⅰ刺激后细胞凋亡率降低(P ＜ 0.05).③caspase-3活性检测表明与对照组相比,氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达,而胰岛素样生长因子Ⅰ 氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低(P ＜ 0.05).结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用,可能与其下调caspase-3蛋白表达有关.     

Puerarin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced apoptosis by upregulating heme oxygenase-1 and inhibiting calpain activation

The aim of this study was to investigate whether puerarin protects against high glucose (HG)-induced apoptosis by suppressing calpain activation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). HUVECs were exposed to normal glucose (NG) (5.5 mm) or HG (33 mm) for 48 h; then, apoptosis and caspase-3 activity were determined. The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA was evaluated by RT-PCR analysis. The activation of calpain and HO activity were also assessed. Compared with the NG group, exposure of HUVECs to HG for 48 h resulted in significant increases in calpain and caspase-3 activity as well as apoptosis, which were prevented by co-incubation with puerarin (1-100 μm) in a concentration-dependent manner. HO-1 mRNA expression and HO activity were decreased in HUVECs treated with HG for 48 h. Compared with the group exposed to HG alone, co-incubation of HUVECs with puerarin and HG induced increases in HO-1 mRNA expression and HO activity. The HO-1 inhibitor protoporphyrin IX zinc (II) abolished the inhibitory effect of puerarin on HG-induced calpain and caspase-3 activation, as well as apoptosis. The data show that puerarin protects against HG-induced endothelial cell apoptosis by a mechanism involving upregulation of HO-1 expression and inhibition of calpain activity.     

活化蛋白C抑制血管内皮细胞凋亡的机制研究

目的 观察活化蛋白C(activated protein C,APC)对线粒体凋亡途径相关调节因子的影响,以阐述其抑制血管内皮细胞凋亡作用的可能机制.方法 人脐静脉血管内皮细胞与脂多糖(1μg/mL)孵育诱导细胞凋亡模型后,分别给予APC(10 ng/mL或50 ng/mL)建立药物治疗组,另设立对照和凋亡模型组,24 h后取材,RT-PCR和Western blotting检测Bcl-2,Bax,P53和Caspase 3 mRNA及蛋白表达.结果 不同剂量APC治疗组与凋亡模型组比较P53,Bax和Caspase 3 mRNA和蛋白表达下调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达上调,尤以APC 50 ng/mL治疗组为显著(P<0.05).结论 APC可能参与调节Caspase 3依赖性的线粒体凋亡途径相关因子的表达,发挥抑制LPS诱导的血管内皮细胞凋亡,从而为APC制剂在感染性疾病中的使用提供了理论基础.     

烟曲霉感染对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的观察烟曲霉菌丝感染后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的凋亡情况。方法建立烟曲霉菌丝感染HUVEC的体外模型。实验分3组:①空白对照组,细胞不予任何刺激;②烟曲霉菌丝组Ⅰ(浓度10~5CFU/mL);③烟曲霉菌丝组Ⅱ(浓度10~6 CFU/mL)。流式细胞术分别于2、4和8 h 3个时相点检测HUVEC凋亡率。结果与2 h比较,暴露于不同浓度烟曲霉菌丝的HUVEC凋亡率在4和8 h逐渐增加(P<0.05);与空白对照组相应时间点比较,烟曲霉菌丝组Ⅰ和烟曲霉菌丝组Ⅱ的HUVEC凋亡率均明显增加(P<0.01),且烟曲霉菌丝组Ⅱ高于烟曲霉菌丝组Ⅰ(P<0.05)。结论烟曲霉菌丝可诱导HUVEC凋亡;一定时间内,随HUVEC接触菌丝时间的延长,凋亡率增加;相同时间点,烟曲霉菌丝浓度越高,HUVEC凋亡率越高。     

Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax

BACKGROUND:

Many studies have showed that apoptosis of endothelial cells plays a curial role in the progress of sepsis. But the role of simvastatin in apoptosis of endothelial cells induced by sepsis is not clear. The present study aimed to investigate the role of simvastatin in apoptosis of endothelial cells induced by sepsis and its mechanism.

METHODS:

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were randomly divided into three groups: control group, sepsis serum intervention group (sepsis group) and simvastatin+sepsis serum intervention group (simvastatin group). After 24-hour incubation with corresponding culture medium, the relative growth rate of HUVECS in different groups was detected by MTT assay; the apoptosis of HUVECs was detected by Hoechst33258 assay and flow cytometry; and the expression of the Bcl-2 and Bax genes of HUVECs was detected by PCR.

RESULTS:

Compared with the sepsis group, HUVECs in the simvastatin group had a higher relative growth rate. Apoptotic HUVECs decreased significantly in the simvastatin group in comparison with the sepsis group. Expression of the Bcl-2 gene in HUVECs decreased obviously, but the expression of the Bax gene increased obviously after 24-hour incubation with sepsis serum; however, the expression of the Bcl-2 and Bax genes was just the opposite in the simvastatin group.

CONCLUSIONS:

Our study suggests that simvastatin can inhibit apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax. It may be one of the mechanisms for simvastatin to treat sepsis.KEY WORDS: Simvastatin, Sepsis, Endothelial cells, Apoptosis, Bcl-2 gene, Bax gene     

凋亡相关基因在金黄色葡萄球菌感染人脐静脉内皮细胞的表达

目的研究凋亡相关基因Bcl-2、Bax和caspase-3在金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染人脐静脉内皮细胞株ECV-304内的表达,探讨其对人脐静脉内皮细胞的凋亡作用。方法采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)法检测S.aureus感染后人脐静脉内皮细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表达水平。结果 S.aureus感染人脐静脉内皮细胞后,其细胞内与抗凋亡相关的细胞因子Bcl-2mRNA水平及蛋白表达量下降,感染12小时差异有统计学意义(P0.01),而促凋亡的细胞因子Bax和caspase-3表达上升,感染6小时差异有统计学意义(P0.01)。结论凋亡相关细胞因子Bcl-2、Bax和caspase-3可能在S.aureus感染所致的脐静脉内皮细胞凋亡中起重要的作用。     

1-甲基色氨酸对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞通透性及凋亡的影响

目的 探讨1-甲基色氨酸(1-methyltryptophan,1-MT)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性及细胞凋亡的影响.方法 将HUVECs分为三组,即磷酸缓冲盐溶液(p...     

Cellular prion protein is expressed on endothelial cells and is released during apoptosis on membrane microparticles found in human plasma

BACKGROUND: Blood and plasma of animals experimentally infected with transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) can transmit TSE infection by transfusion. A conformational isoform of prion protein (PrPsc) is believed to be the TSE-infectious agent that propagates by converting the cellular prion protein (PrPc) to additional molecules of PrPsc. In orally infected animals, PrPsc accumulates in intestinal endothelial cells. In blood, two thirds of PrPc resides in plasma, but its source is not known. STUDY DESIGN AND METHODS: The expression of PrPc in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was studied using flow cytometry, immunoblotting, and RT-PCR. Flow cytometry was used to characterize endothelial membrane microparticles (MPs) in cell culture supernatants and in normal human plasma. RESULTS: HUVECs and bovine aorta endothelial cells express PrPc. The number of surface PrPc molecules per cell in HUVECs was 58,000 +/- 2,800. The induction of apoptosis in HUVECs led to a marked release of membrane MPs (60,000-80,000 MPs/10(3) cells) that expressed PrPc and other endothelial antigens. The presence of endothelial cell-derived MPs expressing PrPc was demonstrated in platelet-free human plasma. CONCLUSION: Endothelial cell apoptosis is associated with the release of PrPc-positive MPs. These MPs contribute to the PrPc pool in plasma and may have a role in disseminating TSE infectivity in blood.