GVHD靶器官中浸润CD3~+T细胞动态变化与组织损伤关系

目的:探讨T细胞在小鼠异基因造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病(aGVHD)靶器官中的浸润及其变化趋势,并研究其与靶组织病理损伤和a GVHD进展的相关性。方法:以8-10周龄雄性C57BL/6(H-2K~b)小鼠为供鼠,获取骨髓细胞、脾单个核细胞,将10-12周龄雄性BALB/c(H-2K~d)小鼠经7.5 Gy全身照射后作为受鼠进行移植。受鼠随机分为异基因骨髓移植(BMT)组和异基因骨髓移植联合脾细胞输注诱导aGVHD(BMT+T)组。移植后每天观察小鼠状态,动态检测各组小鼠体重变化及临床评分;HE染色观察aGVHD靶器官的病理学改变,并做病理评分;免疫组织化学方法动态检测移植后d 7、14、28、40、47靶器官中CD3+T细胞的数量并做数据统计。结果:与BMT组相比,BMT+T组小鼠a GVHD靶器官肝脏、肺以及各段肠道中浸润T细胞数量自移植后d 7开始升高。移植后d 14、28、40、47 BMT+T组小鼠靶组织中浸润的CD3+T细胞较BMT组明显增高(P0.05)。GVHD小鼠的靶器官病理评分和临床评分均明显升高(P0.05)。肝脏中浸润T细胞数量与病理损伤呈正相关,肠道中浸润CD3+T细胞数量与aGVHD临床病理评分亦呈正相关。结论:CD3+T细胞迁移至aGVHD靶组织介导靶器官的病理损伤,T细胞浸润数量是评价aGVHD严重程度的重要指标。     

γ分泌酶抑制剂联合BMSC对小鼠急性移植物抗宿主病的影响

目的:建立aGVHD小鼠模型,探讨低剂量γ分泌酶抑制剂(GSI)联合BMSC对小鼠aGVHD的调控作用及其机制。方法:选择C57BL/6(H-2b)→BALB/c(H-2d)作为异基因移植供、受体,建立aGVHD模型。BALB/c受鼠随机分为6组,分别为照射后输注骨髓细胞组(BM),照射后输注骨髓细胞与脾细胞组(BM+SC),照射后输注骨髓细胞与脾细胞+DMSO组(BM+SC+DMSO)(移植对照组),照射后输注骨髓细胞与脾细胞+GSI组(BM+SC+GSI),照射后输注骨髓细胞与脾细胞及骨髓基质细胞组(BM+SC+BMSC),照射后输注骨髓细胞与脾细胞及骨髓基质细胞+GSI组(BM+SC+BMSC+GSI)。含GSI的两组小鼠在移植后1、2、3 d以腹腔注射GSI 5μmol/kg,以DMSO为对照。观察小鼠一般状况、生存时间及造血恢复情况,ELISA法测定细胞因子,免疫组化检测病理组织学改变等,研究其对allo-BMT后造血重建和a GVHD发生发展的影响。结果:BMSC与GSI联合组的小鼠在观察期内存活率80%,明显高于其他各组小鼠, BMSC、GSI或者两者联合治疗组在移植后21 d以上时,a GVHD的发生率均降低。GSI部分促进白细胞恢复,且对血小板的恢复无明显延迟作用。同时,BMSC与GSI联合组小鼠的外周血清中Th1型细胞因子(IFN-γ)含量明显低于GSI组小鼠(P0.01),联合组Th2型细胞因子(IL-4)含量明显高于GSI组小鼠(P0.01),IL-17含量显著低于相应对照组(P0.001)。结论:低剂量GSI联合BMSC促进造血重建并调节细胞因子IFN-γ、IL-4及IL-17的分泌。GSI联合BMSC达到协同抑制aGVHD发生及进展的目的。     

不同时间输注受者动员脾细胞对小鼠单倍体相合造血干细胞移植后移植物抗宿主病的影响

目的:研究小鼠单倍体相合造血干细胞移植后不同时间输注G-CSF动员的自体脾细胞对移植物抗宿主病(GVHD)的影响,并初步探讨其可能机制。方法:将40只造血干细胞移植后的小鼠随机分为4组(n=10):GVHD阳性对照组(control group)、移植后1 d受者细胞输注组(+1 d group)、移植后4 d受者细胞输注组(+4 d group)、移植后7 d受者细胞输注组(+7 d group)。输注3×10~7的G-CSF动员后的受者脾细胞,观察GVHD临床体征及病理变化,并检测各组外周血中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+细胞亚群及其FasL的表达变化。结果:移植后4 d组的GVHD发生率明显降低,中位存活时间60 d,显著高于对照(24 d)、移植后1 d(21 d)和移植后7 d组(28 d)(P0.01),而外周血中T淋巴细胞Fasl的表达显著低于其他3组(P0.05)。结论:单倍体相合的造血干细胞移植后4 d,输注G-CSF动员的受者脾细胞能抑制供者T淋巴细胞的FasL的表达,显著减少GVHD的发生。     

无关第三方耐受型树突细胞对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病的预防作用

目的 探讨无关第三方耐受型树突细胞(tDC)的生物学特性及其对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用.方法 用GM-CSF、IL-10和TGF-β1诱导培养D1小鼠骨髓源tDC,用流式细胞术检测细胞表型,用RT-PCR方法检测细胞因子基因表达情况.采用混合淋巴细胞反应法检测其体外对异基因小鼠CD4+T细胞增殖的影响;将D1小鼠骨髓源tDC按不同剂量分组输注给aGVHD小鼠模型(B6→D2),观察受鼠一般状况、生存率、临床GVHD评分、血清中Th1/Th2细胞因子水平的变化,并以单纯aGVHD模型为对照组进行比较.结果 流式细胞术检测结果表明tDC表达低水平的MHC Ⅱ分子(I-A/I-E)和共刺激分子(CD80、CD86、CD40).RT-PCR结果表明,tDC低水平表达炎性细胞因子IL-12p40,但高水平表达免疫抑制性因子IL-10、TGF-β、FasL、IDO和精氨酸酶.无关第三方tDC在体外能够有效抑制异基因CD4+T细胞的增殖,并且这种抑制效应与tDC的剂量有关;小鼠体内实验显示,aGVHD对照组小鼠在移植后18 d内全部死亡;而接受无关第三方tDC输注组小鼠aGVHD症状均有所改善,其中输注104 tDC的受鼠有60%能存活至60 d以上,无明显的GVHD症状.而输注103 tDC的小鼠仅有20%能存活至移植后第60天,输注105 tDC的小鼠则在移植后37 d内全部死亡.移植21 d时,输注103、104、105无关第三方tDC的小鼠血清内IL-10水平分别为(114.23±7.78)、(646.18±212.02)、(121.97±10.47)ng/L,104 tDC组显著高于其他组(P<0.05).结论 经IL-10和TGF-β1诱导的无关第三方tDC在体外能够抑制CD4+T细胞的增殖,对aGVHD有显著的预防作用,这种作用与tDC剂量和IL-10的高表达有关.过继性输注一定量的无关第三方tDC能显著延长aGVHD小鼠的生存期,有效预防异基因骨髓移植小鼠aGVHD的发生.     

硼替佐米对小鼠急性移植物抗宿主病作用及其机制研究

目的 探讨硼替佐米(Bortezomib)对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用及其机制.方法 建立小鼠aGVHD动物模型,将小鼠随机分3组,A:移植对照组;B:移植+早期输注硼替佐米组;C:移植+延期输注硼替佐米组.比较各组受鼠aGVHD临床及病理改变、生存率,流式细胞术检测移植后供鼠来源细胞(H-2b+)率.体外建立单向混合淋巴细胞培养(MLC)体系,植物血凝素刺激后,分别用0、2、4、8 nmol/L的硼替佐米作用于反应体系,在不同的时间点收集细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测培养上清IL-2、IFN-γ、TNF-α含量.结果 移植对照组小鼠出现典型的aGVHD症状,3周内死于aGVHD,平均存活时间为16.1 d,移植加早期输注硼替佐米组小鼠aGVHD症状明显减轻,平均生存时间较移植对照组显著延长,60 d时生存率为70%,高于其他组(P<0.05),60 d时H-2b+细胞的百分率为(98.1±1.1)%.移植加延期输注硼替佐米组小鼠aGVHD症状明显较移植对照组加重,平均存活时间较A组缩短.硼替佐米对MLC体系细胞活性的抑制作用表现为剂量依赖关系,8 nmol/L硼替佐米作用24 h后细胞活性抑制率为(41.4±6.0)%;硼替佐米作用于细胞后12、24、36 h的凋亡率逐渐增加,8 nmol/L硼替佐米作用36 h后细胞凋亡率为(62.8±7.0)%;硼替佐米作用24 h后上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度减少.结论 移植后早期输注硼替佐米可显著减轻小鼠异基因移植后的aGVHD、提高生存率,同时不影响骨髓植入;而移植后延期给予硼替佐米则加重aGVHD,导致受鼠死亡率增加.其机制可能是通过抑制淋巴细胞活性,诱导淋巴细胞凋亡,抑制同种反应性细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α.     

SOCS1基因调控未成熟DC及其预防小鼠移植物抗宿主病的功能研究

目的构建慢病毒干扰的树突状细胞(DC)用于预防移植物抗宿主病(GVHD)。方法通过慢病毒转染小鼠骨髓来源DC,构建过表达细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)基因的DC(DC-SOCS1)。用荧光实时定量PCR(RT-PCR)和Western blot方法检测慢病毒转染后的细胞SOCS1在基因和蛋白水平的表达量变化。通过脂多糖(LPS)刺激后,以流式细胞仪检测DC-SOCS1是否依然保持未成熟DC(i DC)的特性。将C57BL/6小鼠分为4组(n≥5),DC-GFP组:输注DC-GFP+异基因小鼠骨髓细胞和脾细胞;DC-SOCS1组:输注DC-SOCS1+异基因小鼠骨髓细胞和脾细胞;i DC组:输注i DC+异基因小鼠骨髓细胞和脾细胞;磷酸盐缓冲液(PBS)组:输注PBS+异基因小鼠骨髓细胞和脾细胞。输注的异基因骨髓细胞量为1×107/只,脾细胞量为2×107/只,DC-SOCS1和DC-GFP的输注量为2×106/只。通过眼静脉将指定细胞输入各组实验小鼠体内,观察小鼠体重、外周血和靶器官组织的病理学变化。以微量标本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测各组Th1细胞因子的分泌水平。结果 1)RT-PCR和Western blot均证实转染后DC-SOCS1细胞内SOCS1表达量明显提高,2)流式检测LPS刺激前后DC-GFP组、DC-SOCS1组和i DC组胞表面共刺激分子表达量,CD80:LPS刺激前为25.34%、23.74%、29.16%,LPS刺激后为67.92%、52.17%、82.42%;CD86:LPS刺激前为46.61%、44.77%、46.18%,LPS刺激后为:80.47%、57.11%、74.10%;MHC-Ⅱ:LPS刺激前27.61%、23.67%、22.86%,LPS刺激后为:90.33%、48.57%、94.58%。3)移植后21 d各组小鼠血细胞恢复情况,WBC(×109/L):2.18±0.32、3.37±0.37、1.12±0.05、1.48±0.20;Plt:330.83±53.04、563.25±71.76、153.27±16.97、101.00±6.01;Hb(g/L):103.83±8.24、128.00±6.19、88.14±7.45、99.75±8.16(P0.05)。4)与DCSOCS1组小鼠相比,其他各组均有不同程度靶组织损伤表现:小肠绒毛断裂坏死,粘膜下层及肌层水肿;肺组织水肿,肺泡腔破坏以及炎性渗出;肝汇管区结构破坏,炎性细胞浸润,肝组织结构紊乱;皮肤出现表皮层水肿,胶原蛋白断裂等。结论经慢病毒转染后的DC-SOCS1具有i DC特性并能够预防小鼠GVHD的产生。     

人羊膜间充质干细胞对异种移植性急性移植物抗宿主病的作用

目的:探讨人羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cell,AMSC)对异种移植的急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)的作用。方法:应用NPG(NOD-Prkdc~(scid) Il2rg~(null),严重联合免疫缺陷)小鼠通过尾静脉注射人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMNC),建立异种移植的aGVHD模型。实验组小鼠分为PBMNC输注组和PBMNC+AMSC共输注组,观察各组小鼠的一般情况、生存期、aGVHD表现、体重及血象变化,应用HE染色观察aGVHD靶器官(肺、肝脏、脾脏、小肠)的病理学改变;采用流式细胞术检测人T细胞在小鼠外周血、组织及器官中的植入水平。结果:PBMNC+AMSC共输注组小鼠的aGVHD表现(倦怠、弓背、耸毛、体重减轻等)及靶器官(肺、肝脏、脾脏、肠)的病理损伤均轻于PBMNC输注组小鼠,且PBMNC+AMSC共输注明显降低了小鼠体内人源T淋巴细胞(CD3~+、CD45~+)植入比例,提高了CD4~+/CD8~+比值。结论:输注人源AMSC能够明显减轻小鼠异种移植的aGVHD表现,改善受体靶器官的病理损伤。     

小鼠脐血移植模型的建立及角质细胞生长因子增强移植后免疫重建的机制研究

目的 探讨角质细胞生长因子(KGF)在小鼠异基因脐血移植(UCBT)后免疫重建中的作用及其机制.方法 取孕19.5 d胎鼠外周血作为脐血移植物.第1批UCBT实验中32只BALB/c小鼠随机分为4组,每组8只,分别输注PBS、1×10~6、2×10~6、3×10~6个脐血单个核细胞(MNC).第2批UCBT实验中24只BALB/c小鼠随机分为3组,每组8只,分别输注1×10~6、2×10~6、3×10~6个脐血MNC,所有小鼠+8 d输注1×10~9个血小板支持.第3批UCBT实验中16只BALB/c小鼠随机分为2组,每组8只,KGF组小鼠TBI前注射KGF,对照组注射PBS,两组都输注2×10~6个脐血MNC,+8 d输注血小板支持.以生存期、脾脏淋巴细胞亚群、胸腺输出功能为观察指标.结果第1批UCBT实验中PBS组小鼠+13.5 d内全部死亡,输注1×10~6、2×10~6、3×10~6个MNC三组小鼠+100 d分别生存2只、3只、3只.第2批UCBT中输注1×10~6、2×10~6、3×10~6个MNC三组小鼠+100 d分别生存7只、8只、8只.第3批UCBT实验中,移植后对照组小鼠脾T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞数分别为(9.57±0.74)×10~6、(0.64±0.06)×10~6、(1.43±0.10)×10~6、(19.13±1.50)×10~6个.KGF输注组分别为(13.47±0.74)×10~6、(0.89±0.03)×10~6、(1.79±0.04)×10~6、(20.50±0.91)×10~6个.KGF输注组T细胞、NKT细胞、NK细胞较对照组高(P＜0.05);对照组小鼠sjTREC水平为(182.2±10.7)拷贝/105个细胞;KGF输注组为(224.2±9.6)拷贝/105个细胞,KGF输注组明显高于PBS对照组(P=0.019).结论 孕19.5 d胎鼠外周血富含造血干细胞,+8 d输注血小板浓缩物可建立异基因UCBT小鼠模型.KGF具有增强小鼠异基因UCBT后胸腺输出功能及促进T细胞免疫重建作用.     

Caspase1抑制剂Ac-YVAD-CMK在防治小鼠急性移植物抗宿主病中的作用

目的:探讨阻断Caspase1对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响及其作用机制。方法:用Caspase1特异性抑制剂Ac-YVAD-CMK阻断Caspase1活化。实验小鼠分为异基因造血干细胞移植联合脾细胞输注(TS组,n=12)、TS+低剂量Caspase1抑制剂(TS+C低组,n=16)和TS+高剂量Caspase1抑制剂(TS+C高组,n=19)共3组。检测各组小鼠体重变化,观察小鼠GVHD临床评分;应用HE染色观察GVHD靶器官的(肝脏、肺、结肠、皮肤)病理学改变,并作病理评分;流式细胞术检测外周血中Th1、Th2和Th17细胞的比例;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血浆中IL-1β、IFN-γ、IL-1α、IL-18水平。结果:AC-YVAD-CMK能减轻小鼠aGVHD:与TS组相比,TS+C低组和TS+C高组的aGVHD严重程度明显减轻(P0.05);通过检测各组小鼠外周血Th细胞亚群发现,与TS组相比,TS+C低组和TS+C高组的Th1细胞比例明显减少(P0.05),Th2和Th17细胞比例明显增多(P0.05);ELISA检测小鼠外周血IL-1β、IFN-γ、IL-18和IL-1α显示,TS+C高组和TS+C低组与TS组相比,上述4种炎症因子水平均明显降低(P0.05)。结论:Ac-YVAD-CMK通过抑制Caspase1活化,减少炎症性介质释放,从而减轻aGVH临床症状和病理损伤。     

间充质干细胞对H-2半相合骨髓移植小鼠免疫功能的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对半相合骨髓移植小鼠免疫功能的影响及机制。方法经8Gy^60Coγ射线照射后，BALB／c（H-2^d）雌性小鼠分为两组：MSC组，尾静脉输注经cm—DiI膜染剂标记的CB6F1（H-2^bd）雌性小鼠的MSC和CB6F1雄性小鼠的骨髓及脾的单个核细胞；对照组，单独输注CB6F1骨髓及脾的单个核细胞。观察两组移植后不同时间外周血中的淋巴细胞亚群，ConA和LPs刺激的T、B淋巴细胞增殖，供受者及第三者混合淋巴细胞反应（MLR），供者骨髓及脾细胞在受者胸腺、骨髓和脾脏的植入率，供者MSC在受者体内分布，急、慢性GVHD的发生率和生存分析。结果移植后90天（＋90天）内，MSC组CD3阳性细胞高于对照组（P〈0．05），＋30天MSC组CD3CD4双阳性细胞百分比和CD4／CD8值高于对照组（P〈0．05）。两组T细胞增殖活性差异无统计学意义。MSC组＋14天后B细胞增殖功能开始恢复，＋30天达到正常值，而对照组＋60天才恢复到正常值。供受者的MLR中MSC组的RR值始终低于对照组；第三者MLR中MSC组与对照组差异无统计学意义。＋30天MSC组受者骨髓和脾中的sry基因多于对照组。移植后MSC主要集中在胸腺、骨髓、肝、小肠，并且大量扩增。对照组急性GVHD发生率高于MSC组（P〈0．05），＋90天对照组出现不同程度的慢性GVHD，MSC组＋120天后出现慢性GVHD，程度轻于对照组。MSC组存活率高于对照组（P〈0.05）。结论MSC促进骨髓干细胞植入，加快C1M淋巴细胞恢复，促进体液免疫恢复，减少GVHD发生率，并且在受者胸腺、骨髓、肝、肠和心内膜下大量扩增，起到修复损伤作用，提高半相合骨髓移植动物生存率。     

骨髓腔输注间充质干细胞对骨髓移植后造血重建和移植物抗宿主病作用的实验研究

目的比较骨髓腔内（IBM）及静脉内（IV）输注异基因间充质干细胞（MSC）对大鼠骨髓移植（BMT）模型的骨髓造血、MSC重建和移植物抗宿主病（GVHD）的影响，优化MSC输注途径及探讨MSC促进造血的机制。方法①MSC体内动力学示踪。②建立大鼠BMT模型。③实验分组：IBM组[MSC（IBM）＋骨髓有核细胞（IV）]；IV组[MSC（IV）＋骨髓有核细胞（IV）]；骨髓移植（BMT）组；单纯MSC组；照射对照组；空白对照组。④移植后观察受体存活、外周血常规结果及植入证据、骨髓MSC、CFU-Mix恢复及GVHD。结果①IBM途径输注MSC主要分布于骨髓。②MSC与骨髓共移植可以提高大鼠存活率：照射对照组、单纯MSC输注组均在预处理后2周内全部死亡；BMT组2周内存活率为70％；IV存活率为80％；IBM组存活率为100％。③MSC可促进BMT大鼠外周血象恢复：移植后第14天（＋14天）移植组白细胞计数均明显高于BMT组，IBM组又明显高于IV组，＋21天IBM组三系均恢复，IV组＋21天白细胞计数恢复，血红蛋白浓度和血小板计数至＋30天恢复正常；BMT组三系恢复延迟约2周。④MSC促进BMT受体骨髓MSC恢复和造血重建：＋21天和＋30天共移植组CFU-Mix和MSC克隆生长恢复均较BMT组快（P＜0．05）；IBM组优于IV组（P＜0．05）。⑤植入证据的检测：BMT及共移植组存活大鼠外周血均检测到F344大鼠供体抗原RT1A’阳性细胞，比例＞90％。⑥GVHD发生率：BMT组GVHD发生率为42％；共移植组无明显GVHD表现。结论IBM输注MSC优先定位于骨髓、极少丢失于非造血器官；输注MSC可促进BMT后造血恢复及提高受体生存率；MSC促进BMT受体骨髓MSC及造血干细胞恢复，缩短骨髓抑制期，并降低GVHD；IBM输注途径效果优于IV途径。     

药物去势与异基因造血干细胞移植后胸腺损伤关系的实验研究

目的 探讨促黄体激素释放激素(LHRH)去势对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后小鼠胸腺功能的保护作用.方法 构建C57BL/6→BALB/c小鼠MHC不相合allo-HSCT模型;对急性移植物抗宿主病(aGVHD)严重程度评分;采用蛋白液相芯片技术榆测小鼠胸腺细胞内IFNγ、TNFα和IL-1β表达水平,实时定量PCR分析小鼠外周血T细胞受体重排删除环(sjTREC)水平.结果 单纯allo-HSCT组(A组)、LHRH处理allo-HSCT组(B组)、同基因移植组(C组)三组小鼠均获得造血重建,WBC>1.0×109/L时间分别为(11.2±1.4)、(9.8±0.6)和(9.7±0.7)d(P=0.003).A、B两组aGVHD出现时间分别为(11.4±1.2)d和(14.1±0.7)d(P=0.000),C组未发生aGVHD,A、B组aGVHD发生率为100%.A组和B组aGVHD评分分别为(9.1±0.7)和(5.1±1.0)分(P=0.000).正常受鼠胸腺细胞内IFNγ、TNFα和IL-1β水平分别为(2.3±2.5)、(1.7±1.1)和(1.8±1.2)pg/ml.A、B、C三组IFNγ水平分别为(10.5±2.1)、(6.7±2.1)和(5.2±3.3)ng/ml;TNFα水平分别为(7.0±2.6)、(4.3±0.8)和(3.0±1.8)pg/ml;IL-1β水平分别为(24.9±9.0)、(17.4±3.9)和(10.8±3.1)pg/ml.A、B组IFNγ、TNFα和IL-1β水平比正常受鼠组明显升高(P值均<0.01);C组IFNγ和IL-1β水平明显高于正常对照组(P值分别为0.015,0.013).A组IFNγ、TNFα和IL-1β水平比B组明显升高(P值分别为0.002、0.002、0.004);A组IFNγ、TNFα和IL-1β水平较C组明显升高(P值均为0.000).Linear Regression分析提示,IFNγ和TNFα水平越高,aGVHD评分越高(r2=0.359,P=0.05;r2=0.228,P=0.019).正常受鼠1000个外周血单个核细胞中sjTREC拷贝数为(39.4±44.7).A、B和C组小鼠分别为(12.3±13.0)、(58.0±71.8)和(19.6±14.6),与正常受鼠组sjTRECs水平差异无统计学意义.结论 细胞因子IFNγ、TNFα和IL-1β参与了aGVHD对胸腺的损伤过程;LHRH药物去势能减轻aGVHD对胸腺的损伤,并通过保护胸腺减轻aGVHD的严重程度,其机制可能与降低胸腺细胞内IFNγ、TNFα水平有关.     

在小鼠骨髓移植中CCR5与急性移植物抗宿主病的相关性研究

本研究评价供者CCR5在经过强化预处理的骨髓移植动物模型受者体内的作用,为今后的异基因造血干细胞移植的临床应用提供科学依据.经过致死剂量照射的BALB/c小鼠接受异基因C57BL/6小鼠的骨髓移植.根据回输的细胞不同实验分为4组:B6 CCR5 KO组,受者接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 WT组,受者接受野生型C57BL/6小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 CCR5 KO BMC组,受者只接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓细胞;B6 WT BMC组,受者只接受野生型C57BL/6小鼠骨髓细胞.结果表明:较之B6 WT组,B6 CCR5 KO组小鼠以更快的速度死于急性GVHD;其受者体内的CD8+T细胞更大量的增殖;其T细胞恢复后产生更多的INF-γ和TNF-α并且由于其T细胞有丝分裂原刀豆素水平处于较高水平,从而进一步促进T细胞的增殖,提示CCR5的作用之一是下调参与排异反应的供者CD8+T细胞的增殖.组织学评价提示,移植剔除CCR5基因受者细胞的小鼠肾脏出现了病理损伤并且肝脏存在有更为严重的病理变化.结论:剔除CCR5基因的异基因骨髓移植使GVHD发病率的增加,供者CD8+T细胞在受者体内增殖增加以及肝肾损害加重,这提示CCR5在异基因骨髓移植中起着重要作用.     

异基因造血干细胞移植早期TNF-α、IL-1β、IFN-γ改变的临床意义

本研究探讨异基因造血干细胞移植患者早期TNF-α、IL-1β、IFN-γ的变化规律,分析其在预处理过程中的改变情况及其与移植相关并发症之间的关系。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测95例异基因造血干细胞移植患者（其中aGVHD纽43例,血栓组5例,感染组31例）预处理前后以及移植后各周内血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平的动态变化,以20例健康成人作为正常对照,观察预处理前后细胞因子的改变,探讨细胞因子和各并发症之间的关系。结果表明：预处理前TNF—α水平在aGVHD组已较正常升高（P〈0．01）,在其他患者中未见明显改变。在预处理第4天后所有患者TNF—α水平都较预处理前明显升高（P〈0．05）,预处理结束时TNF—α水平较预处理前降低。发生aGVHD、血栓或感染时,TNF-α水平均明显升高,以aGVHD组升高更为明显,血栓组TNF—α升高水平大于感染组（P〈0．05）。血栓和aGVHD组的TNF—α水平在发病前2周即有升高,感染组病人在发病前未见改变。IL-1β在移植患者预处理各阶段未见明显变化,发生aGVHD、血栓、感染时IL-1β水平均有升高,以血栓组升高更明显,aGVHD组较感染组也明显升高（P〈0．01）。IL-1β水平在血栓患者发病前2周见明显升高,而aGVHD组于发病前1周升高。IFN-γ水平在移植患者预处理过程中未见明显改变,在各并发症组之间变化不明显。结论：异基因造血干细胞移植过程中细胞因子存在着一系列改变,预处理可造成细胞因子TNF—α释放增加。在aGVHD发生时血清TNF—α水平明显升高,且较血栓患者升高更突出;在血栓发生时,血清IL-1β含量明显升高,并高于aGVHD患者。TNF—α、IL-1β水平的升高和移植相关并发症aGVHD及血栓性疾病的发生关系密切。动态监测TNF-α、IL-1β水平可预测aGVHD厦血栓性病变的发生。     

PTD-mFoxp3融合蛋白对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

本研究探讨静脉输注PTD—mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL／6小鼠为受体并随机分为A、B、c3组,每组10只,移植当天（第0天）接受直线加速器x射线6．0Gy全身照射,4-6h内输注供体BALB／c鼠全骨髓细胞3×10^7＋脾细胞1．5×10^7个。A组于移植前2d和移植后0、1、3、5、7、9、11、13d间断多次输入生理盐水,B组输入mFoxp3蛋白,c组输注等量PTD．mFoxp3融合蛋白。移植后每天观察受体有无移植物抗宿主病的表现;取受体肝脏、空肠上端组织做病理学检查,判断组织损伤及淋巴细胞浸润程度;用ELISA法检测受体外周血中炎性因子IL-2及INF．1浓度;流式细胞术测定长期存活受体外周血供体细胞的比例。结果表明,照射后60d内A、B和c组受体平均生存期分别为（32．95±5．48）d、（38．00±5．45）d和（55．30±3．15）d;病理组织学观察示,A组和B组的小肠及肝脏发生明显的损伤,符合GVHD的表现,c组的病理损伤较轻;酶联免疫吸附测定表明,c组IL-2及IFN-γ浓度明显低于A和B组;长期存活的受体形成了稳定的嵌合体状态,移植后60dA、B、C组活存动物供体细胞比例分别为（79．46±1．80）％、（79．13±2．23）％和（85．92±2．82）％。结论：PTD-mFoxp3融合蛋白可有效降低同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,并减轻其临床表现,降低死亡率。     

腹腔镜与传统开腹手术治疗小儿腹股沟疝的临床效果对比分析

目的探讨腹腔镜与传统开腹手术治疗小儿腹股沟疝的效果差异。方法回顾性选取2018年1月至2020年1月重庆市南川区人民医院收治的接受腹腔镜疝修补术治疗的54例腹股沟疝患儿作为腔镜组,同期采用传统开腹手术治疗的35例腹股沟疝患儿作为传统组。比较2组患儿的手术时间、手术出血量、切口大小、术后下地时间、住院时间、术后2、4、12、24、48 h的疼痛视觉模拟疼痛评分法(VAS)评分、术前和术后24 h炎性应激指标[血清C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和手术并发症发生情况。结果腔镜组患儿的手术时间、手术出血量、切口大小、术后下地时间、住院时间分别为(18.5±3.2) min、(7.5±2.6) mL、(0.6±0.2) cm、(13.6±3.6)h、(3.7±1.0) d,均显著低于对照组[(23.7±4.6) min、(28.5±8.5) mL、(5.1±1.0) cm、(19.6±6.2) h、(5.6±1.7) d],差异均有统计学意义(P <0.05)。术后2~48 h,腔镜组患儿的VAS评分分别为(2.10±0.61)、(2.67±0.81)、(2.50±0.69)、(1.77±0.56)、(1.46±0.48)分,均低于同一时间点的对照组患儿[(2.78±0.84)、(3.28±0.95)、(3.40±0.86)、(3.11±0.74)、(2.50±0.67)分],差异均有统计学意义(P <0.05);术前,腔镜组与传统组患儿的血清CRP、IL-6、TNF-α水平比较,差异无统计学意义(P> 0.05);术后24 h,腔镜组患儿的CRP、IL-6、TNF-α水平分别为(5.58±1.80) mg/L、(66.74±15.28) ng/mL、(28.67±8.78) ng/mL,均显著低于对照组[(10.30±3.17) mg/L、(87.50±18.40) ng/mL、(40.25±12.00) ng/mL],差异均有统计学意义(P <0.05)。术后腔镜组患儿的手术并发症率(1.85%)低于对照组(14.29%),差异有统计学意义(P <0.05)。结论与传统开腹手术相比,腹腔镜疝修补术治疗小儿腹股沟疝具有手术效果可靠、手术创伤小、术后恢复快、术后疼痛程度降低、并发症少的优势。     

高血压心肌梗死与Th1／Th2类细胞因子变化

目的探讨高血压心肌梗死患者Th1／Th2类细胞因子变化。方法临床及冠状动脉造影确诊的高血压心肌梗死患者45例为A（病例1）组,非高血压心肌梗死患者42例为B（病例2）组,冠状动脉造影无心肌梗死的高血压患者48例为C（病例3）组,常规体验健康者20例为D（对照）组。采用放射免疫法检测血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）水平,ELISA法检测血清1干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平。结果①病例1、2、3组Ang-Ⅱ[（94．3±35．4）、（74．4±31．2）ng／L和（63．4±28．9）ng／L]及IFN-γ[（24．3±5．4）、（19．4±3．9）ng／L和（12．1±3．8）]ng／L]较对照组Ang-Ⅱ[（43．4±11．2）ng／L]及IFN-γ[（4．1±1．4）ng／L]水平升高（P〈0．05,P〈0．01）;②病例1组IL-4水平[（14．4±10．7）ng／L与2组[（12．4±2．9）ng／L]、3组[（12．3±6．6）ng／L]及对照组[（11．4±3．9）ng／L]比较差异无统计学意义（P〉0．05）;③病例1、2和3组IFN-1与IL-4比值（0．77±0．33）、（0．62±0．24）和（0．58±0．26）较对照组（0．36±0．19）增大（P〈0．01,P〈0．05）;④Ang-Ⅱ水平与IFN-γ呈正相关（r=0．52,P〈0．01）,而与IL-4水平无相关性（r=0．19,P〉0．05）。结论高血压和非高血压心肌梗死均具有较高的Ang-Ⅱ、IFN—γ及IL-4水平,但高血压心肌梗死Ang-Ⅱ、IFN-γ及IL4水平更高,这是辅助性T细胞亚群Th1／Th2功能失衡的表现;高血压心肌梗死与Th1／Th2失衡,Th1细胞功能亢进密切相关,系统免疫状态和炎性内环境的改变可能对疾病的进展起重要作用。     

流式细胞微球捕获技术检测肾移植受者外周血细胞因子的应用

目的 应用流式细胞微球捕获技术检测肾移植受者外周血细胞因子,分析其在巴利昔单抗应用前后、肾移植手术前后以及移植物排斥反应发生时的含量变化及临床意义.方法 72例肾移植受者根据术后移植物功能状况分为2组:肾功能稳定组53例,急性排斥反应组19例.根据巴利昔单抗使用与否分为2组:巴利昔单抗使用组32例,巴利昔单抗未使用组40例.采集72例肾移植受者术前、术后、急性排斥反应发生时和30名健康供者的外周血,应用流式细胞微球捕获技术分析IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-5、IL-4、IL-2共6种细胞因子含量.对肾移植供者与受者组、肾移植受者术后功能稳定组与急性排斥反应组、术后4周巴利昔单抗使用组与未使用组、巴利昔单抗使用前后细胞因子含量进行比较.结果 术前肾移植受者组外周血TNF-α、IL-10、IL-5、IL-4、IL-2分别为(1.65±0.10)、(2.55±0.19)、(1.88±0.14)、(1.85±0.12)、(2.12±0.09)ng/L,低于健康供者组的(3.04±0.17)、(3.33±0.26)、(4.03±0.25)、(2.73±0.16)、(4.03±0.26)ng/L,差异有统计学意义(t值分别为6.890、2.375、7.851、3.955、7.153,P值分别为<0.01、<0.05、<0.01、<0.01、<0.01);术前肾移植受者组IFN-γ含量为(2.50 ±0.18)ng/L,健康供者组为(3.00±0.24)ng/L,差异无统计学意义(t=1.625,P>0.05).肾功能稳定组IFN-γ、IL-10分别为(2.71±0.11)、(3.91±0.52)ng/L,低于急性排斥反应组的(3.30±0.36)、(12.01±5.35)ng/L,差异有统计学意义(t值分别为5.061、11.465,P值分别为<0.01、<0.05).使用巴利昔单抗的肾移植受者,在巴利昔单抗使用后IFN-γ、TNF-α和IL-10分别为(2.78±0.17)、(1.58±0.07)、(2.77±0.24)ng/L,与使用前的(2.90±0.21)、(1.67±0.12)、(2.45±0.16)ng/L比较,差异有统计学意义(t值分别为5.605、6.011、4.126,P值分别为<0.01、<0.01、<0.05).术后4周巴利昔单抗使用组IFN-γ、IL-10、IL-4分别为(2.90±0.31)、(9.08±0.16)、(2.73±0.11)ng/L,与未使用组的(3.28±0.11)、(4.17±0.21)、(2.11±0.20)ng/L比较,差异有统计学意义(t值分别为4.268、4.263、3.762,P值分别为<0.01、<0.01、<0.05).结论 流式细胞微球捕获技术使用微量标本可同时检测6种细胞因子.联合检测肾移植受者外周血中的细胞因子能够为临床诊疗提供更有意义的指导依据.     

肠道病毒性脑炎患儿外周血T淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞及相关免疫细胞因子水平变化

目的探讨肠道病毒性脑炎(enteroviral encephalitis,EVE)患儿外周血T淋巴细胞亚群、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、相关免疫细胞因子水平变化及其临床意义。方法246例EVE患儿为EVE组,同期体检健康儿童100例为对照组,测定2组外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A、IgG、IgM、白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素-γ(interferonγ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平。结果EVE组CD8^+T淋巴细胞比率[(24.13±9.71)%]、CD3^+T淋巴细胞比率[(61.42±12.26)%]及血清IL-6[(41.63±34.26)ng/L]、TNF-α[(2.92±1.55)ng/L]、IFN-γ[(9.45±4.26)ng/L]水平高于对照组[(20.11±5.98)%、(57.94±10.53)%、(12.45±10.46)ng/L、(2.04±0.73)ng/L、(6.27±3.44)ng/L](P<0.05),CD4^+/CD8^+(1.37±0.75)、CD20^+T淋巴细胞比率[(0.87±0.75)%]、CD3^-CD16^+CD56^+T淋巴细胞比率[(7.87±5.26)%]、IgA[(0.45±0.32)g/L]、IgG[(7.67±1.35)g/L]及血清IL-2[(3.52±1.02)ng/L]水平低于对照组[1.83±1.23、(1.47±1.41)%、(13.23±6.11)%、(1.05±0.22)g/L、(8.02±1.42)g/L、(4.13±1.28)ng/L](P<0.05);EVE组CD4^+T淋巴细胞比率[(28.81±9.56)%]、IgM[(1.35±0.21)g/L、IL-4[(3.17±0.81)ng/L]与对照组[(30.95±9.22)%、(1.34±0.19)g/L、(3.12±0.86)ng/L]比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论T淋巴细胞调节紊乱、体液免疫紊乱可能参与EVE的发病过程。     

异基因外周血干细胞移植治疗白血病中移植物抗宿主病的研究

目的　分析异基因外周血造血干细胞移植 (allo PBSCT)治疗白血病过程中移植物抗宿主病 (GVHD)的发生状况 ,探讨其有效防治方法。方法　allo PBSCT治疗白血病 5 0例 (急性 2 9例 ,慢性 2 1例 ) ;预处理采用环磷酰胺 (CTX) +足叶乙甙 (Vp16 ) +全身照射 (TBI)或CTX +TBI方案 ;32例患者GVHD预防采用常规环孢菌素A(CsA) +短程甲氨蝶呤 (MTX)方案 ;18例患者采用霉酚酸酯 (MMF)联合CsA +短程MTX方案。结果　患者经allo PBSCT均获得造血功能重建 ,中性粒细胞 >0 .5× 10 9 L和血小板 >2 0× 10 9 L时间分别为移植后 14 (10～ 2 2 )d和 2 0 (10～ 6 8)d。发生急性GVHD(aGVHD) 2 0例(40 % ) ,其中Ⅲ～Ⅳ度 6例 (12 % )。生存 6个月以上可评价的 33例中 2 2例 (6 6 7% )发生慢性GVHD(cGVHD) ,其中广泛性 11例 (33.3% )。aGVHD阳性组可溶性白细胞介素 2受体 (sIL 2R)水平为 (2 77.3± 2 6 .4 )U L ,CD2 5+ 细胞为 (8.1± 3.4 ) % ,明显高于aGVHD阴性组 [分别为 (12 8.1± 96 .7)U L和 (3.6±1.7) % ](P <0 .0 5 )。采用MMF联合CsA +MTX方案组aGVHD和广泛性cGVHD发生率分别为 16 .7%和 9.1% ,明显低于常规CsA +MTX方案组 (分别为 5 3.1%和 4 5 .5 % ) (P <0 .0 5 )。本组患者中位随访30 (3～ 70 )个月 ,GVHD阳性组