肠道病毒71型宁波株分子流行病学研究

目的:分析肠道病毒71型2010年宁波分离株的分子流行病学特征。方法:收集2010年宁波市手足口病患者临床标本177份,进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定和病毒分离,采用RT-PCR对38株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增,并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。结果:88份鉴定为EV71的临床标本中共分离到38株病毒,分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.1%～100%和99.3%～100%。与C4a亚型的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.2%～99.3%和98.3%～100%。亲缘进化树显示,宁波分离株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链。结论:宁波地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近,有共同进化的趋势,属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链。     

宁波市肠道病毒71型分离株基因组特征研究

目的:了解2010年宁波市分离的肠道病毒71型的遗传进化来源。方法:设计八对引物用RT-PCR扩增、拼接得到EV71基因组序列,利用DNA-STAR对结构蛋白VP1-VP4和三个前体蛋白P1、P2及P3进行遗传进化分析。结果:宁波株NB10基因组核苷酸序列长度为7406 bp,与北京08年分离株FJ606448基因组间的同源性最高(高达99%),两者结构蛋白氨基酸序列完全相同。NB10与C4亚型的其他参考株,如:安徽株(GQ994988 FY08)、深圳株(FJ607337.1SHEZH08)、等核苷酸同源性均大于98%,而与标准株(BrCr)和(MS-7423-87)的核苷酸的进化关系较远,在P1、P2、P3区,NB10与C4亚型各代表株的同源性均为94%以上;而与北京09株(FJ606450.1)在P3区的核苷酸序列和推导的氨基酸序列之间同源性均较低,分别为87.9%和96.7%。结论:宁波株NB10与中国大陆北京、阜阳、深圳等毒株亲缘关系较近,而与北京株(FJ606450.1)有较大的差异,可能为不同的进化来源。     

大连市肠道病毒71型VP1区段基因特征分析

目的:了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征。方法:从手足口患者粪便标本中分离EV71病毒,经RT-PCR扩增VP1全长,并进行核苷酸序列分析。结果:4株EV71分离株与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性。在系统进化树上,4株EV71分离株与C4亚型代表株处于同一分支。结论:大连市手足口病患者中分离的EV71属C4亚型。     

天津市手足口病分子流行病学分析

目的分析天津市手足口病病原学分布及肠道病毒71型(EV71)分子流行病学特点。方法采集天津市各医院2008—2010年手足口病住院患者粪便标本2 377份,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒核酸;选取部分EV71阳性标本分离病毒,采用RT-PCR扩增其VP1基因,进行序列测定和同源性分析,建立系统发生树。结果 2 377份手足口病粪便标本中,肠道病毒总阳性率为70.72%(1 681/2 377),其中EV71占48.30%,CV-A16占37.36%,其他EV占14.34%;31株EV71分离株与C4亚型的C4a分支参比株具有最高核苷酸序列同源性,同源性为95.7%～99.2%,在系统发生树上均归属于C4a分支。结论天津市2008—2010年手足口病主要病原体为EV71,其流行株为C4亚型中的C4a病毒株。     

四川省急性弛缓性麻痹病例中肠道病毒71型的基因特征分析

目的了解2006-2014年四川省急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例中肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的基因特征。方法对四川省2006-2014年AFP病例中分离到的10株EV71进行全VP1区逆转录-聚合酶链(RT-PCR)反应扩增和核苷酸序列测定,进行序列比对和构建进化树。结果从3 216份AFP粪便标本中,分离出10株EV71病毒。经测序鉴定10株EV71均为C4基因亚型中的C4a进化分支。来源病例的临床诊断分别为:肠道病毒感染3例,格林巴利综合征4例,肌炎3例。10株EV71之间核苷酸同源性为93.6%~98.5%,氨基酸同源性为97.9%~100.0%。结论 2006-2014年四川地区AFP病例中分离到的EV71为C4基因亚型中的C4a进化分支。     

深圳市一起肠道病毒71型引发手足口病流行的基因型别分析

目的 对2004年深圳市一起肠道病毒71型(EV71)引发手足口病流行的基因型别分析.方法 用EV71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VPl和VP4基因进行克隆,所得的序列与EV71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列用TreeView和PHYLIP软件(3.6b)进行系统进化分析.结果 4株病毒与C基因型代表株比较接近,VP1区核苷酸同源性在87.8%～92.0%之间,VP4区核苷酸同源性在85.9%～87.4%之间;与A、B基因型代表株比较差异较大,VPI区核苷酸同源性为81.9%～84.2%,VP4区为80.6%～85.0%;4株病毒VP1核苷酸同源性为94.1%～99.8%,VP4同源性为100%,组成一个独立的小分支.结论 对EV71的VPI和VP4区进行基因进化分析,可得出类似的结果 ,4株EV71深圳流行株可命名为C4亚型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

宁波市2010年-2011年重症手足口病病原学及流行特征分析

目的:了解宁波市手足口病重症病例的病原学类型,为本地区手足口病的综合防制提供参考资料。方法:收集2010年-2011年医院临床诊断为手足口病重症病例的粪便标本,应用RT-PCR技术检测肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)。结果:171例手足口病重症病例中,EV71型病毒占81.28%,CoxA16型病毒占1.75%,其他肠道病毒占16.96%;5月-7月为高发月份,1岁组重症病例最多,重症病例人群男性高于女性(1.76∶1)。结论:EV71型是宁波地区手足口病重症病例的主要致病病毒类型,其流行具有明显的年龄、季节界限。     

长沙市2010年手足口病EV71型VP1区基因序列分析

目的了解2010年长沙市手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）重症和普通病例肠道病毒71型（human Enterovirus 71,EV71）VP1区基因特征。方法收集12例HFMD重症和普通病例的咽拭子或肛拭子标本进行VP1区基因RT-PCR扩增和核苷酸序列测定,测序结果利用sequin软件提交至GenBank,Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对分析和构建进化树。结果 12株EV71 VP1区基因序列在进化树上与C基因型中的C4a亚型代表株属同一分支,在核苷酸同源性分析中,12株EV71与C4a亚型代表株（3254-TAI-98）的同源性达到92.6%-93.3%,高于与A、B、C1、C2、C3、CVA16型或亚型代表株的同源性（分别为79.9%-80.7%、83.1%-84.0%、87.9%-88.7%、89.1%-89.8%8、7.8%-88.2%和57.3%-58.4%）;12株EV71病毒VP1之间的核苷酸有高度的同源性：同源性为98.1%-100.0%,高于与C4亚型代表株的同源性（92.6%-93.3%和91.8%-92.7%）。2010年分离自长沙的重症和普通病例与2008年分离自北京、深圳和阜阳的EV71病毒VP1基因序列之间的氨基酸变异位点少。结论 2010年长沙市流行的EV71型病毒属于C基因型中的C4亚型;12例HFMD重症和普通病例的EV71 VP1区基因序列差异较小;不同时间、不同地区和不同病例来源的EV71 VP1区氨基酸变异位点无关联。     

手足口病重症病例特征分析及其病原型别分子鉴定

目的对2009年北京市西城区某哨点医院手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)重症病例特征进行初步分析,通过病原学分子分型鉴定,全面了解其病原构成,为重症HFMD的防控提供基础。方法采集重症HFMD患者咽拭子标本,提取病毒RNA。用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒(EV)核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;用肠道病毒VP4区分型引物进行半巢式RT-PCR(RT-nPCR),通过测序和序列分析对非EV71、非CoxA16型EV进行分型鉴定。结果 2009年4～12月,共采集HFMD重症标本35例,发病时间主要集中在6～8月,多为3岁以下婴幼儿。通过实时荧光RT-PCR检测,8例阴性,27例EV阳性,其中,13例EV71阳性,2例CoxA16阳性;12例非EV71、非CoxA16型EV经半巢式RT-nPCR检测,均扩增出目的片段,其中10例测序成功,并通过NCBI BLAST序列比对确定病毒型别:CoxA5和CoxA10各2例,CoxA2、CoxA4、CoxA6、CoxB5、Echoll、人鼻病毒各1例。结论重症手足口病发病高峰为6～8月,3岁以下婴幼儿为主要发病人群。2009年该哨点医院重症HFMD病原型别多样,以EV71为优势型别。     

2010年池州地区手足口病病原学分析

目的分析池州地区手足口病的流行病学和病原学特征,为手足口病防控提供科学依据。方法采集2010-03/2010-12池州市各地送检的133例手足口病临床诊断患者的咽拭子,应用RT-PCR技术检测样本中肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)。结果 133例手足口病临床诊断病例咽拭子中,检测到肠道病毒阳性79份,EV71阳性28份,CoxA16阳性24份,EV71和CoxA16的阳性率为21.05%和18.05%。6例手足口病重症病例中,EV71病毒感染病例4例。结论 EV71和CoxA16是2010年池州地区手足口病的主要病原体,而EV71是引起手足口病重症病例的主要类型。     

德阳市2010年手足口病监测结果分析

[目的]了解2010年德阳市手足口病患者中肠道病毒的主要血清型及EV71毒株的基因型别,为德阳市手足口病的预防控制提供科学依据。[方法]采用实时荧光PCR方法对四川省德阳市手足口病疑似病例的68份咽拭子或疱疹液标本进行肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)型和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)的病毒核酸检测。并对2份EV71阳性标本进行VP1区核苷酸序列测序和进化树分析。[结果]68份标本中,CoxA16阳性率41.18%(28/68),EV71阳性率17.65%(12/68),其他肠道病毒阳性率为7.35%(5/68)。2份EV71毒株VP1区的核苷酸序列进化树分析,证实均属C4基因亚型。[结论]2010年德阳市手足口病以CoxA16感染为主,EV71及其他非CoxA16、非EV71肠道病毒并存。2份德阳EV71毒株经VP1区测序证实为C4基因亚型,与中国内地流行株基因亚型一致。     

2009年镇江市肠道病毒71型的分子流行病学研究

目的:扩增2009年镇江市肠道病毒71型(EV71)vp1基因的核苷酸序列,同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解2009年镇江市肠道病毒71型的基因组序列特征及可能的传播来源。方法:采集临床手足口病(HFMD)患者咽拭子标本,抽提病毒RNA,通过巢式PCR扩增肠道病毒71型vp1基因的核苷酸序列。利用Clustal X和MEGA5.0分析软件,进行同源性分析和构建系统发生树。结果:序列进化分析表明,测序获得的11株病毒基因与C基因型代表株比较接近,尤其与C4基因亚型最为相近,并且可进一步划分为C4a进化枝。说明本文的11株病毒皆属于EV71病毒C基因型、C4a亚型。结论:2009年镇江市的EV71病毒株可能与阜阳分离的EV71病毒有相同的起源,均属于C4a亚型,并且C4a亚型的EV71病毒在中国大陆有较广泛的分布和传播。     

2010一2011年湖南省郴州市手足口病EV71型VP1区基因序列分析

目的了解2010-2011年湖南省郴州市手足口病EV71病毒的基因特征,为手足口病的预防控制提供科学依据。方法从2010-2011年郴州市各县（市、区）送检的手足口病肛拭子标本中随机挑选60份标本采用RD细胞进行病毒分离,采用Realtime—RT—PCR方法检测肠道病毒核酸,挑选14株致细胞病变阳性且EV71核酸检测阳性的标本（其中2010年的4株均为郴州市手足口流行夏季高峰期分离株,2011年的毒株主要为冬季高峰期分离株）,采用RT—PCR法扩增出EV71分离株的VP1区片段,随后进行VP1区核苷酸序列测定和分析,并使用生物信息学方法作基因特性分析。结果郴州市14株EV71毒株在生物进化树上与CAa亚型的代表株属同一分支。14株EV71毒株之间核苷酸序列的同源性在96．1％～100．0％之间,氨基酸序列的同源性在99．3％～100．0％之间;与A、B、C各基因型和亚型代表株EV71VP1编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分析表明,郴州各分离株与安徽阜阳2008年毒株C4a亚型代表株（EU703812）的同源性最高,其中核苷酸同源性在91．8％-93．3％之间,氨基酸同源性均为99．3％。14株分离株与安徽阜阳2008年毒株（C4a亚型代表株）VP1区段的氨基酸编码序列进行比较,发现K98E、S283T和A293S3处位点变异,重症病例与普通病例的EV71病毒VPI氨基酸变异无明显差异。结论2010-2011年郴州市手足口病的优势毒株EV71属于C4a基因亚型。郴州市各县（市、区）的EV71亲缘关系近,毒株基因较稳定,未发现氨基酸突变位点与病例类型有关联。