实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立

目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.     

采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

实时荧光定量RT-PCR与ELISA检测孕妇血清风疹病毒的比较分析

目的应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术定量检测孕妇血清标本中风疹病毒RNA,并与ELISA法比较其敏感度与特异度,为孕妇早期风疹病毒检测提供迅速准确的方法。方法收集126例已确诊风疹病毒阳性孕妇血清标本与107例女性健康查体者血清标本,同时进行实时荧光定量RT-PCR核酸检测与风疹病毒ELISA法IgM抗体检测,比较两种方法的敏感度与特异度。结果以细胞培养法为金标准,实时荧光定量RT-PCR法敏感度为92.9%,特异度为98.1%。ELISA IgM抗体法的敏感度和特异度分别为97.6%,86.9%。两种方法的敏感度无显著性差异（p〉0.05）,实时荧光定量RT-PCR法的特异度明显高于ELISA IgM抗体法（p〈0.01）。结论实时荧光定量RT-PCR简便快捷、敏感性高、特异性高、定量准确,在临床风疹病毒基因检测中具有很大的应用潜力。     

博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立

目的：建立博尔纳病病毒(BDV)荧光定量套式RT-PCR检测方法，为快速、准确地定量检测BDV奠定基础。方法：根据BDV P24基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的BDV P24基因片段克隆入载体，重组质粒经筛选、鉴定后，作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测。结果：应用量组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板具有良好的线性关系，相关系数为0．998，建立了检测BDV的荧光定量套式RT-PCR方法。检测58例神经精神病患者及50例健康人外周血单核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段，3例精神分裂症及1例帕金森病患者呈阳性，其余均为阴性。结论：荧光定量套式RT-PCR方法能够避免PCR后处理导致的假阳性污染，并实现准确定量，对于研究BDV感染与人类神经精神疾病的关系有很好的应用价值。     

增强型荧光实时PCR——高灵敏度SARS冠状病毒检测方法

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory sydrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS-coronavirus,SARS-CoV)引起的传染性强、病死率高的疾病[1-4].其传播的主要途径是通过近距离呼吸道飞沫传播.     

SARS病原体的检测及其在动物模型鉴定及疫苗评价中的应用

目的:通过RT-PCR及病毒分离等方法，鉴定SARS感染性动物模型是否成立，并对疫苗效果进行评估。方法:选用3周岁的健康SPF级恒河猴8只，分为SARS实验感染动物模型组及疫苗组(Sino 3 SARS灭活疫苗20030904批肌内注射，免疫2次)。经鼻吸入Sino 1 SARS毒株，病毒攻击后7d动物进行安乐死。自病毒攻击后的第一天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第二天、第五天、第七天采集血浆标本。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测．结果：模型组动物病毒攻击后第一天至第七天咽拭子RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第一天咽拭子RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆RB-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示仅在模型动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽拭子标本分离到病毒．血浆标本中均未分离到病毒．结论：RT-PCR及病毒分离可以及时有效地检测出病毒在体内的复制情况，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。     

猴免疫缺陷病毒荧光定量聚合酶链反应检测标准品的体外合成

【目的】合成猴免疫缺陷病毒(SIV)荧光定量检测标准品,并总结出核糖核酸(RNA)标准品体外合成的基本原则。【方法】首先寻找到SIV保守序列,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆于T载体,测序,然后在所测得的SIV序列中进一步寻找保守序列,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所获得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,再用PCR和电泳检测验证。【结果】通过数次引物调整,最终成功合成了SIV荧光定量PCR标准品。【结论】SIV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则:①必须选择保守序列;②在选择保守序列之后还需要搜索是否含有较多潜在的终止密码或者起始密码,设计引物使这些中止或起始密码排除在PCR目标产物之外;③必须注意将启动子(如T7启动子)挂在适当的引物上,以保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成好RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完毕的DNA。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,χ2=8.1, P<0.005。结论通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。     

TaqMan real-time fluorescent quantitative RT-PCR in detection of macrophage in-flammatory protein-2γ mRNA in myocarditis murine

Objective: To study the role of macrophage inflammatory protein (MIP)-2γ in myocarditis pathogenesis in BALB/c mice. Methods: The relationship, between the progression of Coxsarckie virus B3 ( CVB3 ) viral myocarditis and experimental autoimmune myocarditis and MIP-2γ mRNA expression in mouse was studied by TaqMan real-timefluorescent quantitative RT-PCR. Results: MIP-2γ mRNA expression rose on 3 to 5 d after CVB3 infection, reachedpeak on 7 d, and returned to normal level until 14 d, which corresponded well with the disease course. The MIP-2γ/mRNA expression level rose significantly on the day 18 d after immunization with porcine cardiac myosin, which wasconsistent with pathological examination. Conclusion: MIP-2γ/may be involved in the pathogenesis of myocarditis.     

实时荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌骨转移相关基因表达的研究

目的研究CXCR4、CTGF、MMP-1、IL-11、MST1R、ETV-1 6种基因在鼻咽癌细胞5-8F与骨共培养前后的表达情况,分析这些基因在鼻咽癌骨转移中的作用。方法采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RT-PCR检测5-8F细胞与骨共培养前后骨转移相关基因的表达情况。结果5-8F细胞与骨共培养后CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1的表达水平较共培养前差异有显著性(P<0.05),均表达上调;MMP-1、IL-11则差异无显著性。结论实时荧光定量RT-PCR能够敏感、特异地检测出鼻咽癌细胞在与骨组织共培养前后的mRNA的表达变化,方法准确可靠,操作方便;CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的潜在标志物。     

丙型肝炎病毒核酸的荧光定量检测及其临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV-RNA含量方法的临床应用价值。方法:在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,PCR扩增目的片段并构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的巢式RT-PCR进行定性分析。结果:138例样本在HCV抗体阳性患者中,肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(P<0.05),而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.91)。结论:RFQ-RT-PCR检测HCV-RNA含量比ELISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HCV在体内的复制情况。     

定量RT-PCR检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达

目的:检测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)mRNA的表达水平,并探讨其临床价值.方法:采用实时荧光定量RT-PCR法检测51例经病理学确诊的结直肠癌患者和30例健康对照者外周血CK20 mRNA的表达水平.结果:结直肠癌患者中CK20 mRNA阳性率为27.45%,而健康对照组阳性率为6.67%,两者相比差异有统计学意义(P<0.025).随着临床分期的提高,患者外周血中CK20 mRNA的表达率随之提高,但各分期间阳性率相比无显著统计学意义(P>0.05).Dukes'C期与D期患者中>10拷贝/ml者高于A期与B期患者.结论:检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达水平可发现早期脱落的肿瘤细胞,对肿瘤微转移的诊断有一定的提示意义.     

荧光定量RT-PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因的表达

目的　了解急性白血病患者外周血WT1基因的表达水平。方法　建立荧光定量RT -PCR方法 ,用PEABI 770 0PCR仪检测 114例急性白血病患者、2 6例非白血病患者和3 6例正常人外周血中WT1基因的表达水平。结果　 2 2例急性髓系白血病 (AML)和 15例急性淋巴细胞白血病 (ALL)初发患者WT1基因的表达量为 10 5～ 10 6拷贝 / μgRNA ,取得部分缓解的 2 6例AML和 19例ALL患者的表达水平为 10 2～ 10 4拷贝 / μgRNA ,而取得完全缓解的 17例AML和 13例ALL患者的表达水平为 0～ 10 2拷贝 / μgRNA。 结论　WT1基因在白血病外周血中有高水平的表达 ,可作为急性白血病疗效考核及监测微残留病的指标。     

阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立阿尼昂尼昂病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 针对阿尼昂尼昂病毒nsP1基因设计特异性引物和探针,以珠海国际旅行卫生保健中心之前构建的MS2病毒样颗粒为标准品,采用一步法建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的检测下限、特异性、精密度、抗干扰能力、符合率进行评价.结果 建立的阿尼昂尼昂病毒实...     

荧光定量RT—PCR快速检测手足口病病原研究

目的建立荧光定量RT—PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术，设计一对共引物及探针，建立、优化反应体系后，构建质粒标准品，利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线，根据TCID。倍比稀释，建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT—PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为10^5／μl（R^2=0．999），PCR扩增效率为94％。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5．0TCID50／ml（R^2=0．99），PCR扩增效率为97．6％。荧光RT—PCR检出率为80．9％，显著高于RT—PCR（检出率为62．92％）。结论研究建立的荧光定量RT—PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高，可以作为肠道病毒的快速检测方法。     

荧光定量RT-PCR检测宫颈癌患者外周血MMP-9mRNA表达的临床意义

目的 研究宫颈癌患者外周血中MMP-9 mRNA的表达,探讨其临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR技术,检测98例经病理证实的宫颈癌及25例妇科良性肿瘤对照组外周血液中MMP-9mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关系.结果 98例宫颈癌组外周血MMP-9mRNA阳性率为76.5％,而对照组为48.0％(P＜0.01).在宫颈癌组内,早期宫颈癌(Ⅰ～ⅡA期)外周血MMP-9mRNA阳性率为63.5％,而中晚期宫颈癌(Ⅱb-Ⅳ期)为88.6％(P＜0.05).早期宫颈癌患者MMP-9mRNA的表达与肿瘤分期(ⅠA、ⅠB、ⅡA)、病理类型(鳞癌、非鳞癌)、淋巴转移(+/-)、肿瘤大小(＜4cm、≥4 cm)等均无显著性相关(P＞0.05).仅与年龄(＜40岁、≥40岁)、组织分化(G1-2、G3)、脉管瘤栓(+/-))显著相关(P＜0.05).结论 荧光定量PCR技术可检测出各期宫颈癌患者外周血中MMP-9的表达,有较高的敏感性和特异性,在判断宫颈癌预后、监控复发中的应用具有一定的可行性.     

SARS冠状病毒N蛋白的真核细胞定位研究

目的:为进一步探讨SARS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)在病毒复制及细胞通路中的作用,观察了核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.方法:应用核定位序列分析软件分析N蛋白序列,找出其中的核定位信号序列;构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SARS-CoV不同长度核衣壳蛋白区段融合表达的pEGFP-C1重组载体,对293细胞进行瞬时转染,在荧光显微镜下观察核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.结果:不同的核定位信号分析软件分析的结果不同,Prosite找到的核定位信号位于N蛋白第373-389或374-390aa,而PredictNLS server找到的核定位信号位于N蛋白第36-44aa;全长核衣壳蛋白及第161-422aa区段均定位于细胞质,第1-187aa区段定位于细胞质和细胞核.结论:SARS-CoV核衣壳蛋白的核定位信号可能位于N蛋白第36-44aa.     

SARS患者T淋巴细胞核仁区嗜银蛋白含量测定的临床意义

目的　研究外周血T淋巴细胞核仁区嗜银蛋白 (AgNORs)染色对严重急性呼吸综合征(SARS)的诊断意义。　方法　PHA刺激外周血T淋巴细胞培养 ,KL型肿瘤免疫图像分析系统分析AgNORs区面积与细胞核仁区的百分比 (I.S %) ,同时观察培养后的细胞形态变化。 　结果　I .S %在 8例正常健康对照组为 7.38± 0 .75 ,8例非SARS肺炎组为 8.98± 0 .91,4例SARS(均为地方患者 )组为 1.6 7± 1.13。SARS患者细胞培养后其体积较正常对照组或非SARS组小 ,很少见到被银染的颗粒 ,提示SARS患者的T淋巴细胞对PHA刺激几乎无反应 ,尤其是病情危重的病人更显著。　结论　AgNORs降低对SARS有一定的临床诊断意义 ,也可以作为病情加重的指标 ,细胞形态变化更加明显。