Sprouty1载体的构建及对NF-κB转录活性的调控影响

目的构建pCMV-MYC-SPRY1表达载体,应用荧光素酶报告基因实验研究pCMV-MYC-SPRY1对NF-κB信号转导通路的影响,以及对HEK293细胞增殖调控的研究。方法采用PCR技术在肝文库里扩增SPRY1编码的目的基因片段,将其构建到真核表达pCMV-MYC载体上,用荧光素酶报告基因实验验证其对下游报告基因NF-κB转录活性的影响以及用GENMEDMTS细胞增殖检测试剂盒检测pCMV-MYC-SPRY1对HEK293细胞增殖的影响。结果成功构建pCMV-MYC-SPRY1表达载体,表明SPRY1负调控NF-κB的活性,对HEK293细胞增殖具有抑制作用。结论 pCMV-MYC-SPRY1表达载体的成功构建及对NF-κB转导通路的研究,为进一步研究SPRY1基因编码的蛋白质的功能打下了基础。     

细胞角蛋白18真核表达载体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建人细胞角蛋白18(CK18)真核表达载体,以研究CK18与NF-κB信号通路的关系.方法 经PCR扩增CK18基因片段,用pCMV-Myc及pDsRed1-N1载体构建真核重组质粒,瞬时转染HEK293细胞,用Western blot方法检测pCMV-Myc-CK18的表达,在荧光显微镜下观察pDsRed1-N1-CK18的定位情况.用双荧光素酶报告基因系统,检测CK18对NF-κB信号通路的影响.结果 构建了人CK18真核表达载体,发现CK18定位于细胞质,并抑制NFκB的转录活性.结论 构建了人CK18真核表达载体,CK18负调控NF-κB信号通路.     

表达荧光素酶报告基因稳定细胞系的建立及对CBLB502活性的检测

目的 建立表达NF-κB-RE-luc2P荧光素酶报告基因的稳定细胞系以检测CBLB502的活性.方法 利用脂质体转染试剂Lipofectin2000将含有NF-κB报告基因的质粒NF-κB-RE-luc2P转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),并通过潮霉素B进行克隆筛选,最后挑取单克隆进行放大并应用荧光素酶检测方法进...     

TRAF6截短体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的 构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)截短体,鉴定TRAF6截短体及对核因子-κB (NF-κB)信号通路的影响区域.方法 采用PCR技术扩增TRAF6 4个截短体(N1、N2、N3、C1)编码基因,分别将其构建在pFlag-CMV2重组载体,用荧光素酶报告基因方法对TRAF6 4个截短体功能活性进行验证....     

IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响

目的 构建含有信号肽的全长IFN-λR1质粒,研究在配体IFN-λ1存在的情况下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响.方法 利用多次PCR将信号肽编码序列引入IFN-λR1序列中,构建表达载体,用免疫荧光及膜蛋白分离实验鉴定IFN-λR1的表达定位.用免疫共沉淀的方法研究IFN-λ1刺激下IFN-λR1与TRAF6间的相互作用.用双荧光素酶报告基因实验研究IFN-λR1与TRAF6相互作用后对下游NF-κB与ISRE活性的影响,采用实时定量PCR的方法检测此种作用对OAS1与Mx1基因表达的影响.结果 成功构建了含信号肽的全长IFN-λR1表达载体,细胞内表达的IFN-λR1可正确定位于细胞膜上.细胞共转染IFN-λR1和TRAF6,在免疫沉淀物中可以检测到两个蛋白同时存在.细胞内共表达的IFN-λR1能够抑制TRAF6诱导的NF-λB的激活,而共表达的TRAF6可以抑制IFN-λR1下游ISRE的活性,并下调OAS1与Mx1基因的表达.结论 证实了在IFN-λ1存在下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及二者相互作用对各自细胞信号转导通路的影响,为TRAF6作为IFN-λ受体信号通路中的相互作用蛋白提供了新的实验依据.     

TRAF2 K48聚泛素化位点的研究

目的筛选K48聚泛素链在肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated facto r 2,T RA F2）上的主要修饰位点。方法比较不同物种间的T RA F2氨基酸序列,选出人T RA F2上保守率在90%以上的赖氨酸。构建人野生型TRAF2的表达载体及保守赖氨酸突变为精氨酸的突变表达载体。将不同的TRAF2表达载体与NF-κB荧光素酶报告基因表达载体共转至293FT细胞中,通过荧光素酶检测NF-κB激活情况。结果人TRAF2上共有8个保守率在90%以上的赖氨酸,酶切及测序结果证明本研究成功构建TRAF2野生型和突变型表达载体。NF-κB荧光素酶报告基因检测证明TRAF2-K320可能是K48聚泛素链的主要修饰位点。结论 TRAF2-K320位点对TRAF2介导的NF-κB激活具有负向调控作用。     

TRAF6在NF-κB信号通路中的修饰与降解

目的：研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在调节NF-κB通路中的作用机制。方法：利用转导了并稳定表达。TRAF6基因的293RZC细胞株，用荧光素酶报告基因系统测定CoA1对293RZC细胞NF-κB通路的激活，Westem Blot分析在NF-κB通路激活过程中TRAF6和IκBα的降解。结果：CoA1可诱导293RZC细胞NF-κB通路的激活，在这一过程中，TRAF6被修饰并降解，IκBα也发生降解，二者的降解被蛋白酶抑制剂MG132抑制。结论：TRAF6介导NF-κB通路的激活需要蛋白酶复合体的作用。     

RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31 的
shRNA片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装
质粒PMD、SPA共转染293T 细胞,在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染
HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot 检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB
转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot 检测下调RNF31对
IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31载
体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107 pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑
制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使
细胞凋亡增多。结论RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。
     

华蟾素注射液对HepG2细胞NF-κB通路的影响

目的探讨华蟾素注射液对肝癌细胞株HepG2NF-κB通路的影响。方法在TNF-α激活NF-κB通路的条件下利用双荧光素酶报告基因系统检测华蟾素注射液对含有NF-κB反应元件的萤火虫荧光素酶报告基因pNF-κB-TA-luc转录活性的影响。Western blotting进一步验证华蟾素注射液对HepG2细胞核内NF-κB亚基p65蛋白量的影响,同时半定量RT-PCR检测NF-κB下游靶基因细胞间黏附分子1(ICAM-1)的转录水平。结果0.25、0.5μg/ml浓度的华蟾素注射液可有效地抑制pNF-κB-TA-luc报告基因的相对荧光素酶值(P<0.05)。Western blot结果进一步证明华蟾素可使NF-κB亚基p65蛋白量降低,RT-PCR结果表明NF-κB下游靶基因ICAM-1表达降低。结论华蟾素注射液的抗癌机制可能与抑制癌细胞NF-κB通路的活化有关。     

Klotho基因启动子区域定位及活性分析

目的构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性。方法以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性。结果双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01)。结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因。     

丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL-1信号途径中的作用

目的:确定MEKK3分子中介导IL-1信号途径的关键性氨基酸.方法:对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后,用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES-1细胞中;用免疫印迹、NF-κB 荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL-1及TRAF6介导的NF-κB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响.结果:通过与野生型MEKK3的对比,观察到526A不但阻断了IL-1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NF-κB基因的激活,同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用.结论:526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL-1信号途径中起关键性的作用,是不可缺少的关键性氨基酸.     

miR-196a2成熟区单核苷酸多态性对靶基因LSP1表达的影响

目的:研究miR-196a2成熟区单核苷酸多态性rs11614913(T/C)对预测靶基因LSP1表达的影响.方法:构建含有不同基因型miR-196a2的真核表达载体pCDNA3.1-miR196a2-C和pCDNA3.1-miR196a2-T;同时利用化学合成含有不同基因型的成熟miR-196a2探针miR-196a2-C和miR-196a2-U.将靶基因LSP1的3'UTR序列克隆至pMIR-REPORTTM Luciferase载体中而获得LSP1报告基因载体pMIR-LSP1.采用所构建的miR-196a2真核表达载体以及化学合成的成熟miR-196a2探针分别与靶基因LSP1报告基因载体组建两套转染体系.分别共转染于HEK293、A549和CHO 三种细胞后进行荧光素酶活性分析.结果:miR-196a2真核表达载体与靶基因LSP1报告基因表达载体共转染于HEK293、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析.pCDNA3.1-miR196a2-C等位基因荧光素酶相对活性与pCDNA3.1-miR196a2-T等位基因相比均有显著降低(P<0.05);含不同基因型的化学合成的成熟miR-196a2探针与靶基因LSP1报告质粒共转染HEK293、A549和CHO三种细胞,miR-196a2-C等佗基因荧光素酶活性与miR196a2-T等位基因相比也有显著降低(P<0.05).结论:荧光索酶活性强弱间接反映了miR-196a2与靶基因LSP1结合能力的大小.当miR-196a2成熟区rs11614913位点为C时,miR-196a2可能更为有效地与预测靶基因LSP1结合,从而在转录后水平调控靶基因表达.     

核转录因子NF-κB调节人肾小管上皮细胞SIGIRR表达机制的研究

目的 探讨人肾小管上皮细胞(HKC)内核转录因子NF-κB(NF-κB)反馈调控单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)表达的分子机制。方法 分子克隆法构建pLNCX2-G418-SIGIRR过表达载体，经PT67细胞包装后感染HKC细胞，构建SIGIRR过表达细胞和对照细胞。使用IL-1β诱导，Western blot验证过表达SIGIRR可抑制NF-κB活化。使用NF-κB阻断剂和干涉NF-κB活性后，免疫荧光法验证活化的NF-κB可调控SIGIRR表达。在线工具预测SIGIRR启动子区存在NF-κB结合位点。分子克隆法从人基因组DNA内获取含有结合位点的SIGIRR启动子序列，连接至荧光素酶载体pGL3-Luc,构建pGL3-Luc-SIGIRR,并突变结合位点。使用荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀技术(ChIP)共同验证活化的NF-κB可结合在SIGIRR启动子区调控SIGIRR基因的表达。结果 构建的pLNCX2-G418-SIGIRR逆转录病毒载体经酶切、测序验证后对比SIGIRR基因编码序列完全一致，重组体和对照载体经病毒包装后转入HKC细胞后成功构建HKC/...     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

稳定表达人TLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系的建立

目的 构建人Toll样受体-5(hTLR5)和NF-κB信号通路响应的荧光素酶(luciferase)-绿色荧光蛋白(GFP)报告分子的慢病毒质粒,获得稳定表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系.方法 通过PCR及全基因合成方法获得hTLR5和5×NF-κB结合位点序列,分别构建pWSLV-hTLR5-puro和pWSLV-5×NF-κB-nanluc-GFP慢病毒质粒;将2个慢病毒质粒分别与包装质粒共转染HEK-293T细胞进行慢病毒包装,将获得的慢病毒上清经浓缩后共感染HEK-293细胞,经嘌呤霉素筛选和流式细胞分选后得到表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞.经传代后,采用Western印迹法和免疫荧光法鉴定hTLR5表达情况,荧光显微镜下观察并采用荧光素酶定量法检测不同浓度细菌鞭毛蛋白(flagellin)对NF-κB信号通路的激活情况.结果 质粒酶切鉴定及DNA测序结果表明插入目的片段与预期相符,重组慢病毒质粒构建正确;HEK293-N-T细胞高表达hTRL5,且hTLR5能正确定位到细胞膜表面;鞭毛蛋白能显著激活HEK293-N-T细胞的NF-κB信号通路,且具有剂量依赖关系.结论 正确构建了hTLR5和NF-κB信号通路响应的荧光素酶-GFP报告分子的慢病毒质粒,并成功建立了稳定表达hTLR5及NF-κB响应报告分子的HEK-293细胞系.     

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的 克隆DsbA-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法 以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增DsbA-L基因5’端2115bp片段（从翻译起始点ATG上游-2128~-14区域）。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。随后,构建5’端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果 成功构建人DsbA-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128~-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人DsbA-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论 成功构建人DsbA-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。     

Mob1a真核表达载体构建方法及对MEN通路基因表达的 影响研究

目的 探讨Mobla真核表达载体构建方法 及对MEN通路基因表达的影响.方法 利用PCR扩增技术扩增出Mobla编码基因,将其构建到真核表达Mobla载体上,利用脂质体将构建的真核表达载体瞬时转染干细胞,采用Western blot检测Mobla蛋白是否表达,采用荧光素梅报告基因实验对MEN通路基因表达活性的影响.结果 本研究成功构建Mobla真核载体,经过小鼠肝脏细胞转染后能对其蛋白质进行提取,Western blot显示:Mobla质粒在小鼠肝脏细胞中表达水平未见异常.荧光素酶报告基因试验进结果 显示:Mobla能抑制MEN通路基因信号,能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路转录活性.结论 采用PCR扩增技术能成功扩增、构建出Mobla真核表达载体,并且对MEN通路基因表达存在一定的影响.     

糖皮质激素抑制人前列腺癌PC-3细胞系增殖的可能机制

目的:观察地塞米松对前列腺癌PC-3细胞中转录因子NF-κB及其下游靶基因cyclinD1的调节作用,探讨其抑制PC-3细胞增殖的可能机制.方法:MTT法检测地塞米松对PC-3细胞增殖的影响;转染和报告基因的方法比较多种肿瘤细胞中NF-κB的基础转录活性并检测地塞米松对PC-3细胞NF-κB转录活性的调节;Western 印迹法检测地塞米松对PC-3细胞cyclinD1蛋白表达的影响.结果:地塞米松抑制PC-3细胞的增殖;PC-3细胞中NF-κB处于组成型激活状态,地塞米松抑制PC-3细胞中转录因子NF-κB的转录活性;地塞米松下调PC-3细胞中cyclinD1蛋白的表达.结论:地塞米松抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,这可能与其抑制转录因子NF-κB的转录活性及其下游的靶基因cyclinD1的蛋白表达有关.     

丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL-1信号途径中的作用

目的：确定MEKK3分子中介导IL-1信号途径的关键性氨基酸。方法：对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后，用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES-1细胞中；用免疫印迹、NF-κB荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL-1及TRAF6介导的NF-κB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响。结果：通过与野生型MEKK3的对比，观察到526A不但阻断了IL-1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NF-κB基因的激活，同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用。结论：526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL-1信号途径中起关键性的作用。是不可缺少的关键性氨基酸。