人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

乙型肝炎病毒表面抗原人源单链可变区抗体基因的克隆与鉴定

目的 筛选,鉴定抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗ＨＢＶ的基因治疗研究奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯化铯超速离心法纯化的ＨＢｓＡｇ蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”淘洗过程,获得抗原结合活性较强的ＨＢｓＡｇ人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ScFv)。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果 筛选得到的ScFv片段具有抗HCV核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV核心蛋白的特异性人源单可变区抗体的编码基因。     

抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达

目的　用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体。　方法　用抗体框架区的通用引物 PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体 NP11- 4的 VH 及 VL 基因 ,测序分析其核苷酸序列。用VH 和 VL 基因在 p THA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达。　结果　扩增获得 NP11- 4的 VH 和 VL基因 ,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列 ,构建成排列顺序为 VH- linker- VL 的单链抗体基因 ,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体 ,大小约为 36 .2 k Da,以包涵体形式存在。　结论　成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。     

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的 构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础. 方法 从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库. 结果 成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达107. 结论 以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体.     

抗HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

本文利用基因工程技术,在成功构建抗HBV PreS2 3B9mAb单链可变区抗体(ScFV)基因的基础上,在389 ScFv基因中引入限制性内切酶位点,克隆的噬菌体表达载体pCANTAB5噬菌粒中。经转染TG1     

丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

人源性老年痴呆单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础.方法 从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA.以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变区基因片段(VH、VL),并分别克隆入噬菌粒pDAN5中,构建出含人单链抗体可变区(scFv)基因序列的pDAN5克隆载体,电转化感受态大肠杆菌XLI-Blue后,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建成初级噬菌体抗体库.从抗体库中随机挑选数个克隆,提取质粒,PCR扩增目的片段后,用内切酶BstN Ⅰ消化,每个克隆经消化后的DNA指纹印迹用琼脂糖凝胶电泳分析,评价抗体库的多样性.结果 所有抗体VH和VL基因片段均得到了扩增并成功克隆及转化,经辅助噬菌体感染后,构建成初级抗体库.BstN Ⅰ消化后的DNA指纹图谱显示各克隆抗体基因各不相同,经计算构建的噬菌体抗体库容量为1.5×106.结论 利用噬菌体抗体库技术成功构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。     

噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎表面抗原单链抗体库

[目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库。[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),用Linker连接肽经重叠PCR将VH和VL基因连接成VH-Linker-VL形式的ScFv基因。将ScFv与pCANTAB-5E载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成全套人源性抗HBsAg ScFv库。[结果]成功构建了人源性抗HBsAg噬菌体ScFv库。[结论]人源性HBsAg噬菌体ScFv库的构建,为进一步筛选特异性高,具有治疗作用的乙肝抗体奠定基础。     

Expression and identification of recombinant soluble single—chain variable fragment of monoclonal antibody MC3

AIM: To generate soluble single chain variable fragments (ScFv) of monoclonal antibody MC3 recognizing colorectal and gastric carcinomas. METHODS: mRNA was isolated from the hybridoma cell line producing MC3 and the DNAs encoding variable domains of heavy and light chains (VH and VL) of the antibody were amplified separately by RT-PCR and assembled into ScFv DNA with a linker DNA. The ScFv DNA was ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into E.coli TG1.The transformed cells were infected with M13KO7 helper phage to yield recombinant phages. After two rounds of panning with gastric carcinoma cell line AGS highly expressing MC3-binding antigen, the phage clones displaying ScFv fragments of the antibody were selected by ELISA. 4 phage clones showing strong signal in ELISA were used to infect E.coli HB2151 to express soluble ScFvs. The soluble ScFvs were identified by Dot blot and Western blot, and their antigen-binding activity was assayed by ELISA. The VH and VL DNAs of the ScFv DNA derived from phage clone 19 were sequenced. RESULTS: The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp, 320 bp and 750 bp respectively. After two rounds of panning to the recombinant phages, 18 antigen-positive phage clones were selected from 30 preselected phage clones by ELISA. All the soluble ScFvs derived from the 4 out of the 18 antigen-positive phage clones were about M(r)32000 and concentrated in periplasmatic space under the given culture condition. The soluble ScFvs could bind the antigen, and they shared the same binding site with MC3. The sequences of the VH and VL DNAs of the MC3 ScFv showed that the variable antibody genes belonged to the IgG1 subgroup,kappa-type. CONCLUSION: The soluble ScFv of MC3 is successfully produced, which not only provides a possible novel targeting vehicle for in vivo and in vitro study on associated cancers, but also offers the antibody a stable genetic source.     

抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链基因的串联及克隆

目的：制备抗日本血吸虫虫卵尿素溶性抗原单克隆抗体33F5的基因工程单链抗体。方法：利用杂交瘤细胞总mRNA抽提、逆转录技术及PCR方法、获得单抗重链和轻链可变区基因，通过linker将其连接，并克隆到表达载体PCANTAB5E中。结果：酶切显示，重链和轻链可变区基因及ScFv片段与预设计的大小一致。结论：获得抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链串联的基因克隆。     

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值

目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体,用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库。方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者。从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断。用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1。用辅助噬菌体M13K07援救转化后的TG1,产生ScFv。结果95例慢性ITP患者中41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%)。2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能。扩增出380～400bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780bp大小的ScFv片断。ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆。用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml。结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能。用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/ⅢaScFv。     

单抗MGb1的噬菌体呈现型ScFv片段的制备

目的 制备胃癌单抗ＭＧｂ１的噬菌体呈现型单链可变区片段（ＳｃＦｖ）,为获得用于胃癌体内诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。方法 从杂交瘤细胞分离ｍＲＮＡ,扩增抗体重,轻链可变区（ＶＨ和ＶＬ）ｃＤＮＡ,经ｌｉｎｋｅｒＤＮＡ连接形成ＳｃＦｖ ＤＮＡ。将ＳｃＦｖＤＮＡ与ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的连接产物转化于大肠杆菌ＴＧ１,经Ｍ１３ＫＯ７感染后,获得重组噬菌体抗体ＳｃＦｖ。经亲和筛选和ＥＬＩＳＡ检测获得呈现ＭＧｂ     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

A melanoma-specific VH antibody cloned from a fusion phage library of a vaccinated melanoma patient.

The human antimelanoma antibody V86 was cloned from a single-chain Fv molecule (scFv) fusion phage library displaying the heavy chain variable domain (VH) and light chain variable domain (VL.) repertoire of a melanoma patient immunized with genetically-modified autologous tumor cells. Previous ELISA tests for binding of the V86 fusion phage to a panel of human metastatic melanoma and carcinoma cell lines and primary cultures of normal melanocytes, endothelial, and fibroblast cells showed that measurable binding occurred only to the melanoma cells. In this communication, the strict specificity of V86 for melanoma cells was confirmed by immunohistochemical staining tests with cultured cells and frozen tissue sections. The V86 fusion phage stained melanoma cell lines but did not stain carcinoma cell lines or cultured normal cells; V86 also stained specifically the melanoma cells in sections of metastatic tissue but did not stain any of the cells in sections from normal skin, lung, and kidney or from metastatic colon and ovarian carcinomas and a benign nevus. An unexpected finding is that V86 contains a complete VH domain but only a short segment of a VL, domain, which terminates before the CDR1 region. This VL deletion resulted from the occurrence in the VL cDNA of a restriction site, which was cleaved during construction of the scFv library. Thus V86 is essentially a VH antibody. The effect of adding a VI. domain to V86 was examined by constructing scFv fusion phage libraries in which V86 was coupled to Vlambda or Vkappa domains from the original scFv library of the melanoma patient and then panning the libraries against melanoma cells to enrich for the highest affinity antibody clones. None of the V86-Vlambda clones showed significant binding to melanoma cells in ELISA tests; although binding occurred with most of the V86-Vkappa clones, it was generally weaker than the binding of V86. These results indicate that most of the VL domains in the original scFv library reduce or eliminate the affinity of V86 for melanoma cells. Accordingly, VH libraries could provide access to anti-tumor antibodies that might not be detected in scFv or Fab libraries because of the incompatibility of most randomly paired VH and VL, domains.     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的鉴定

目的　研制抗日本血吸虫循环抗原SjMAg的单链抗体。　方法　用日本血吸虫成虫代谢抗原SjMAg包板,对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行3轮富集,然后用ELISA法从富集的次级抗体库中筛选阳性克隆,最后借助ELISA、SDSPAGE和Western印迹等方法,根据阳性克隆表达产物与其它4种吸虫抗原反应的情况,进行特异性鉴定。　结果　从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个,经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。　结论　用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆,获得的抗体克隆可用于抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的制备。     

从人源免疫抗体库筛选抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体

目的 获得高亲和力的全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法 以健康供血者的外周血淋巴细胞为来源,以PreS1肽体外致敏后,借助噬菌体展示技术构建人源免疫单链抗体库,库容量7×10 8。 结果 以PreS1肽进行3轮固相筛选。获得了亲和力10 7～10 8mol/L的抗PreS1单链抗体。结论 通过体外致敏的方法构建人源免疫抗体库,可以快速获得高亲和力基因工程抗体。