人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

hTERT启动子调控hNIS基因介导肺癌细胞碘摄取和131I治疗的实验研究

目的 构建含人端粒酶反转录酶(hTERT)核心启动子调控的人钠/碘同向转运体(hNIS)基因重组腺病毒,并靶向转染至肺癌A549细胞中特异性表达.探讨hTERT启动子调控的hNIS基因介导放射性碘治疗肿瘤的可能性.方法 应用AdEasy系统构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV.hNIS作为阳性对照,不含hNIS的重组腺病毒Ad-CMV作为阴性对照.应用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性,摄碘实验检测表达的hNIS蛋白功能,细胞克隆形成实验评价131I对转染肿瘤细胞的毒性作用.结果 成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS及Ad-CMV,并经PCR验证正确.RT-PCR证实hNIS cDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来.Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS转染的肺癌A549细胞摄碘能力比阴性对照组Ad-CMV转染的细胞分别提高了23和31倍,且摄碘能力可以被NaClO4抑制.Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS转染的肺癌A549细胞均可被131I杀死,2组细胞成活率分别为(31.2±1.45)%和(23.6±4.08)%,而阴性对照组和未转染病毒组分别为(89.0 ±2.99)%和(91.2 ±4.63)%.结论 hTERT启动子调控的hNIS重组腺病毒转染肿瘤细胞后,应用131I治疗有望成为一种新的基因靶向治疗手段.     

hNIS基因转染介导Hela细胞移植瘤放射性核素显像和治疗的实验研究

Objective To explore the feasibility of imaging and treatment of cervical cancer xenograft model using 131I mediated by hNIS gene transfection. Methods The cervical cancer xenograft models were established with Hela-NIS( +) cells and Hela cells, respectively. Five Hela-NIS( +) xenograft models and five Hela xenograft models were dynamically imaged at 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 and 20 h postinjection of 131I(7.4 MBq). Five Hela-NIS( +) xenograft models were imaged at 0. 5,1,2,4,8,16, 20 and 25 h postinjection of 99TcmO4-(11.1 MBq). Twenty Hela-NIS( +) cervical cancer xenograft models were randomly divided into four groups: Three 131I treating groups and one control group. The therapeutic effects of 131I at threelevels (74,111,148 MBq) were investigated following intraperitoneal injection. Results Hela-NIS( +)human cervical cancer xenografts were established successfully in nude mice. The Hela-NIS( +) xenografts significantly accumulated radioactivity after intraperitoneal injection of 131I, and the radioactivity was persistently present until 20 h postinjection, but Hela xenografts had no radioactive accumulation. The T/B value of the Hela-NIS( +) xenografts reached 17.34 at 8 h postinjection. The imaging with 99TcmO4- showed that the radioactivity was persistently present in Hela-NIS( +) xenografts for almost 25 h. The Hela-NIS( +)xenografts shrinked after 131I treatment. The inhibition ratios of tumor growth in 111 MBq and 148 MBq groups were both significantly higher than that of 74 MBq group (t: 2.74-5.75, P ＜0.05). Conclusions Hela-NIS( +) cervical cancer xenografts in nude mice could persistently accumulate 131I and 99TcmO4- and could be treated successfully with 131 I. 131 I treatment mediated by hNIS gene transfection could be a promising cancer treatment method.     

hNIS基因转染介导Hela细胞移植瘤放射性核素显像和治疗的实验研究

目的 利用131I对转染hNIS基因的宫颈癌Hela-NIS（＋）细胞移植瘤进行显像及治疗实验研究,评价hNIS基因转染介导131I治疗宫颈癌的可行性.方法 （1）利用Hela-NIS（＋）细胞和未转染hNIS的Hela细胞分别建立荷宫颈癌裸鼠模型,进行131I及99TcmO4-显像,观察移植瘤的显影情况,并计算移植瘤部位与对侧相同部位的T/B比值.（2）通过腹腔注射法观察比较74,111和148 MBq131I对荷Hela-NIS（＋）宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用,另设不行任何治疗的对照组.用SPSS 13.0软件,样本均数间差异行t检验.结果 （1）成功构建荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤与荷Hela裸鼠移植瘤模型.131I显像示荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤部位明显放射性浓聚,注射后8 h T/B比值最高达17.34,而未转染hNIS基因的荷Hela裸鼠移植瘤部位始终未见明显的放射性浓聚.99TcmO4-显像示荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤部位在注射后25 h内持续放射性浓聚.（2）经不同剂量的131I治疗后2～3周起,各治疗组荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤生长开始受到抑制,移植瘤体积有不同程度缩小.111MBq组和148 MBq组的移植瘤抑制率差异无统计学意义（t=0.13～2.17,P＞0.05）,但二者均明显高于74 MBq组的移植瘤抑制率（t=2.74～5.75,P＜0.05）.对照组荷Hela-NIS（＋）裸鼠移植瘤持续生长.结论 荷Hela-NIS（＋）宫颈癌裸鼠移植瘤可明显聚集131I及99TcmO4-,且在较长时间内持续清晰显影;131I体内治疗效果显著.     

hNIS基因的靶向性转染介导肝癌131I治疗

目的探讨鼠白蛋白基因启动子／增强子（mAlb）调控下人钠／碘同向转运体（hNIS）基因的组织特异性表达介导^131 I治疗肝癌的可行性。方法构建mAlb调控下萤光素酶表达载体和mAlb引导下hNIS/潮酶素共表达的重组逆转录病毒载体，后者用脂质体法转染包装细胞获取重组逆转录病毒颗粒感染鼠肝癌细胞MH3924A，建立稳定表达细胞系，并在体内和体外水平评价重组肝癌细胞对^125 I的摄取和流出，以及”。I对转染后肝癌细胞的杀伤作用及在移植瘤模型中的生物分布。结果体外培养条件下，hNIS基因稳定转染细胞系摄取^125 I高出野生型肝癌细胞240倍，该摄取过程可被Na^＋／K^＋-ATP酶抑制剂哇巴因（Ouabain）和NIS特异性阻断剂NaCIO4阻断。在含3．7MBq/ml^131 I的培养液中培养7h后，重组肝癌细胞和野生型肝癌细胞存活率分别下降了86％和8％。静脉注射^131I后，重组肝癌细胞移植瘤摄取量较对照高出19．2倍，静脉注射治疗剂量的^131 I后重组肝癌细胞移植瘤的生长明显受抑制。结论证实mAlb引导下hNIS基因的组织特异性表达介导^131I治疗肝癌的可能性，但疗效有待进一步提高。     

hNIS基因的组织特异性表达介导肝癌细胞摄取99Tcm

目的探讨人钠／碘同向转运体（hNIS）基因在肝癌细胞中的组织特异性表达介导^99Tc^m摄取的可行性。方法构建鼠白蛋白基因启动子／增强子（mAlb）引导下hNIS和潮酶素共同表达的逆转录病毒载体，该重组逆转录病毒感染大鼠肝癌细胞MH3924A建立稳定表达细胞系，用^125I摄取实验证实hNIS基因的功能表达。建立肝癌移植瘤大鼠模型。在体内和体外水平评价重组肝癌细胞对^99Tc^m的摄取和流出。绘制时间-放射性曲线和体内外放射性分布图。结果重组质粒构建成功。体外培养条件下，hNIS基因稳定转染细胞系摄取^99Tc^m高出野生型肝癌细胞254倍。50μmol／L NaClO3和500μmol／L哇巴因（Ouabain）可分别使MHm AlbhNIS6细胞摄取^99Tc^m降低97．56％和88．20％（P均〈0．01）。而^99Tc^m流出迅速，有效半减期不足2min，应用^99Tc^m／γ相机系统获得了转染肿瘤的清晰图像及定量数据，注射^99Tc^m O4^-后30min，MHmAlbhNIS6细胞形成的移植瘤摄取^99Tc^m比对照组高4倍。结论证实hNIS基因在肝癌细胞中的组织特异性表达介导^99Tc^m摄取；利用^99Tc^m／γ相机系统可无创、简单、定量检测hNIS基因的表达。     

hNIS基因介导碘摄取测量microRNA let-7在肺腺癌A549细胞中的表达

目的 拟建立用放射性核素测量mieroRNA(即miRNA)在肿瘤细胞中表达的新方法 ,探讨miRNA与肿瘤的关系.方法 分别克隆人钠/碘同向转运体(hNIS)及可与let-7互补结合的ras 基因的3'非翻译区(3'-UTR),即RU序列;以hNIS作为报告基因,将ras基因的3'-UTR与hNIS连接构建融合基因(hNIS-RU),使Hnis的表达受let-7的调控;同时克隆前体let-7(pri-let-7)及前体mir143(pri-mir143),转入细胞后加工形成成熟的let-7及mir143.将hNIS及hNIS-Ru分别转染肺腺癌A549细胞,转染24 h后,于培养液中分别加入37 kBq ~(125)I,1h后收集细胞并测量~(125)I计数;将hNIS-Ru分别与不同量的pri-let-7或pri-mir143共转染A549细胞,转染细胞24 h后分别测量其对Na~(125)I的摄取.结果 转染hNIS的A549细胞~(125)I摄取明显增高,是未转染A549细胞的12倍;转染hNIS-RU的A549细胞~(125)I的摄取减低,为转染hNIS A549细胞的70%,是未转染A549细胞的8倍;hNIS-Ru及pri-let-7共转染A549细胞的放射性计数进一步降低,为转染hNIS A549细胞的50%;转染hNIS-Ru不变,增加pri-let-7的转染量,~(125)I的摄取随pri-let-7的增加而降低;转染hNIS-Ru不变,共转染不同浓度的pri-mir143,A549细胞对~(125)I的摄取基本不变.结论 构建了hNIS-Ru融合基因,hNIS在细胞中的表达受let-7的调节,二者呈反比关系.初步建立了以hNIS为报告基因测量miRNA在细胞中表达的高灵敏度放射性核素新方法.     

杆状病毒介导NIS基因放射治疗甲状腺癌的实验研究

目的探讨重组钠／碘同向转运体(NIS)基因杆状病毒介导甲状腺癌细胞放射性碘治疗的可行性。方法构建杆状病毒载体质粒(pFBNIS)并制备重组NIS杆状病毒(BacNIS)，体外感染甲状腺癌细胞，通过免疫荧光检测NIS蛋白的表达，通过动态摄碘及NaC104摄碘抑制实验观察表达蛋白的功能和特性；进行^131I杀伤细胞的克隆形成实验。结果成功构建了重组NIS杆状病毒，受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控；BacNIS体外感染的甲状腺癌细胞表达的NIS蛋白具有摄碘功能和NaC104抑制的特性；BacNIs感染的肿瘤细胞可被^131I有效杀伤。结论BacNIS是介导肿瘤细胞摄碘的有效方法，为杆状病毒介导NIS基因治疗失分化甲状腺癌转移灶提供依据。     

钠碘同向转运体基因介导放射性碘治疗肿瘤的研究进展

钠碘同向转运体(NIS)作为一种细胞膜蛋白,主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜并介导细胞的碘转运,在甲状腺癌及非甲状腺癌的放射性碘治疗研究中备受关注.部分甲状腺癌的NIS表达水平降低或者膜蛋白定位不好,通过导入NIS基因进行膜表达,介导核素滞留于细胞内,是肿瘤治疗的新途径.但目前主要存在核素在细胞内滞留时间短而影响疗效的问题.对此,在导入NIS基因后,可通过各种方法刺激肿瘤细胞增加NIS的功能性表达而增加核素的摄取,也可通过减少核素的流出来提高其滞留,扩展NIS基因治疗的应用范围,优化肿瘤治疗.该文主要综述了NIS基因介导的肿瘤治疗研究进展.     

钠碘转运体基因介导的肿瘤放射性核素治疗研究

钠碘转运体(NKS)是一种跨膜糖蛋白,介导碘的主动摄取,使得放射性碘用于治疗不摄碘的肿瘤成为可能。目前NIS基因已被成功转入多种肿瘤并表达出有功能的NIS蛋白,但治疗的效果并不令人满意。为此,研究者们应用不同的方法进行了改进,并收到较好的效果。     

重组NIS基因腺相关病毒的制备及其在甲状腺癌细胞系表达

目的探讨钠碘同向转运体（NIS）基因介导的甲状腺癌基因治疗的可行性。方法构建腺相关病毒载体质粒pGA—NIS，并采用磷酸钙沉淀法制备重组NIS基因的腺相关病毒rAAV—NIS，体外感染甲状腺癌细胞系FTC-133、8505C后，通过免疫荧光检测被感染细胞的NIS蛋白表达，并通过摄碘实验及NaClO4摄碘抑制实验验证其表达的NIS蛋白功能和特性。结果成功制备了重组NIS基因的rAAV—NIS，其感染肿瘤细胞所表达的NIS蛋白位于细胞膜上，且具有介导碘摄取的功能，以及被NaClO4抑制的特性，表明与正常甲状腺细胞的NIS具有相同的功能和特性。感染细胞的碘摄取较未感染细胞明显增高。结论rAAV—NIS能介导甲状腺癌细胞的碘摄取，为甲状腺癌NIS基因介导的基因治疗提供了实验依据。     

维甲酸诱导甲状腺癌细胞摄碘的实验研究

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导甲状腺癌细胞系的钠碘同向转运体(NIS)表达及其碘摄取。方法通过ATRA诱导甲状腺癌细胞系滤泡状甲状腺癌细胞株(FIE-133)、乳头状甲状腺癌细胞株(W3)及未分化甲状腺癌细胞株(8505C)后，经逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测甲状腺癌细胞系的NIS mRNA及其蛋白质表达，并测定甲状腺癌细胞系诱导后的摄碘变化。结果ATRA诱导甲状腺癌细胞系48h后，FTG-133和W3的NIS mRNA及蛋白质表达增高，8505C未见变化；ATRA诱导甲状腺癌细胞系2周后．FTC-133和W3的摄碘增高。结论ATRA能诱导分化型甲状腺癌细胞摄碘增高，为ATRA诱导分化治疗甲状腺癌提供了依据。     

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

125I粒子对Hela细胞杀伤作用的实验研究

目的观察体外Hela细胞在^125I粒子照射下细胞凋亡和增殖的规律，探讨^125I粒子对肿瘤的杀伤作用。方法用^125I粒子照射Hela细胞，用不同的方法观察不同剂量和时间点细胞的增殖反应及形态变化。结果受照射细胞发生凋亡，于Ⅱb期出现凋亡小体；细胞凋亡率随累积剂量的增加而增加，于5Gy时出现凋亡率峰值；细胞克隆形成率显著下降，与凋亡形成呈反向关系。并有反剂量率效应。结论^125I粒子对肿瘤的治疗作用可能为早期抑制肿瘤细胞增殖，晚期使肿瘤细胞大量凋亡。