Smad7质粒转染对肝星形细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响

目的:研究上调Smad7表达对肝星形细胞(HSC)α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因转录的作用.方法:应用Fugene6介导Smad7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞.继续培养48 h.同时使用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR),逆转录酶链式反应(RT-PCR)方法检测Smad7质粒组和正常对照组、空载质粒对照组α(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:与正常对照组和空载质粒对照组相比,Smad7质粒转染HSC-T6细胞48h后,Smad7 mRNA水平显著增高(1.29±0.18 vs 0.11±0.02,0.13±0.02,均P<0.01),α1(Ⅰ)前胶原mRNA表达明显下降(0.10±0.01 vs 1.18±0.15.1.07±0.12,均P<0.01),但α1(Ⅲ)前胶原基因表达无明显改变(0.72±0.00 vs 0.70±0.01,0.75±0.0l,均P>0.05).结论:Smad7能明显抑制HSC细胞α1(Ⅰ)前胶原mRNA转录.     

大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中的表达

目的:构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7对肝星状细胞HSC-T6的转染.并进一步研究其对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA达水平的影响.方法:采用基因重组技术将Smad7 cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染HSC-T6细胞,分为正常对照组、空质粒组及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞,运用Western blot检测Smad7蛋白表达情况,RT-PCR检测Smad7、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较,Smad7 mRNA表达显著增加(1.053±0.009 VS 0.984±0.054,0.986±0.044,P<0.01或0.05),蛋白水平显著上调(0.083±0.02 VS0.058±0.050,0.056±0.064,均p<0.05:Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低(0.961±0.013 VS 1.039±0.013,1.032±0.037;0.592±0.096 VS 0.767±0.085.0.770±0.090,均P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义.正常对照、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAA达差异无统计学意义.结论:smad7可能参与TGF-β/smad信号转导,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性.     

Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。     

当归补血汤有效组分及其配伍对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

目的观察当归补血汤有效组分及其配伍对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路的调控作用.方法当归的有效成分阿魏酸、黄芪的有效成分黄芪甲苷单独应用及联合处理HSC-T6细胞24 h,收集细胞,Western blot检测HSC-T6细胞Ⅲ型胶原蛋白、Smad4和Smad7蛋白表达,实时定量PCR检测HSC-T6细胞Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达.结果阿魏酸显著抑制HSC-T6细胞中Ⅲ型胶原蛋白和Smad4蛋白表达(均P0.05),抑制Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达(均P0.05),对Smad7蛋白表达无显著性影响(P0.05),黄芪甲苷对这些指标均无显著性影响(均P0.05).与阿魏酸单独处理组比较,联合处理的作用效果无显著性提高(均P0.05).结论当归补血汤的有效组分阿魏酸通过TGF-β1/Smad信号通路抑制了肝星状细胞Ⅲ型胶原蛋白表达.     

芦荟大黄素和吡喹酮联合治疗对血吸虫肝纤维化小鼠TGF-β/Smad通路的影响

目的:探讨芦荟大黄素和吡喹酮的联合治疗对血吸虫肝纤维化小鼠TGF-β/Smad通路的影响.方法:80只小鼠随机分为4组.前3组每只小鼠感染日本血吸虫尾蚴25条,感染8 wK(后,第一组小鼠以吡喹酮500 mg/(kg·d)治疗2 d(吡喹酮组),第2组小鼠以吡喹酮500 mg/(kg·d)治疗2 d后用芦荟大黄素0.3 mg/(kg·d)治疗8 wk(吡喹酮+芦荟大黄素组),第3组不作任何治疗(实验对照组),第4组小鼠作为正常对照.第16周末处死小鼠留取肝脏组织.应用HE染色法、RT-PCR法和免疫组织化学染色法观察、分析各组小鼠肝脏病理改变与Smad2 mRNA、Smad7mRNA、TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的表达变化.结果.芦荟大黄素治疗后血吸虫肝纤维化程度减轻,肝组织中Smad2 mRNA、TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达明显低于实验对照组和吡喹酮组(q=6.20,4.38;q=6.22,4.41;q=6.30,4.52;q=6.25,4.44;q=6.29,4.48,P<0.01或0.05);肝组织中Smad7mRNA的表达,明显高于实验对照组和吡喹酮组(q=6.32,4.62,P<0.0 1或0.05).结论:芦荟大黄素可通过降低肝组织中TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达,抑制Smad2基因的表达,促进Smad7的表达发挥抗肝纤维化作用.     

抗纤灵对慢性肾衰竭小鼠心脏TGF-β_1/Smad通路的影响

目的观察抗纤灵对5/6肾切除小鼠诱导的慢性肾衰竭心脏转化生长因子-β1(TGF-β_1)、Smad3、Smad7 mRNA表达的影响,从心脏TGF-β_1/Smad信号通路的角度探讨抗纤灵治疗慢性肾衰竭心脏病变的作用机制。方法按Platt法建立慢性肾衰竭小鼠模型,造模成功后,随机将手术组小鼠分为模型组、缬沙坦组、抗纤灵组,每组9只。抗纤灵组予抗纤灵方煎剂0.5mL灌胃,药物浓度为20g/kg,每日1次;缬沙坦组予缬沙坦0.5mL灌胃,药物浓度为20mg/kg,每日1次;模型组和假手术组均予等量蒸馏水灌胃,连续灌胃22周。22周后计算各组小鼠心脏胶原面积,用real-time PCR法检测TGF-β_1、Smad3、Smad7 mRNA的表达。结果与假手术组比较,模型组的心脏胶原面积、TGF-β_1及Smad3 mRNA显著增高(P<0.01),Smad7 mRNA显著降低(P<0.01)。与模型组比较,抗纤灵组的Smad3 mRNA有改善(P<0.05),心脏胶原面积、TGF-β_1mRNA、Smad7 mRNA有显著改善(P<0.01);缬沙坦组的心脏胶原面积、TGF-β_1 mRNA、Smad7 mRNA明显改善(P<0.01),Smad3 mRNA有改善(P<0.05)。抗纤灵组与缬沙坦组组间比较,在改善心脏胶原面积、降低TGF-β_1 mRNA、Smad3 mRNA的表达及升高Smad7 mRNA的表达方面差异无统计学意义。结论抗纤灵能通过调节TGF-β_1/Smad信号通路改善慢性肾衰竭引起的心脏病变。     

Wnt抑制因子-1对肝星状细胞活化的影响

目的观察wnt抑制因子-1（WIF）对转化生长因子β1（TGF-β1）活化肝星状细胞（HSC）的影响。方法构建真核表达质粒pEGFP-C1-WIF并通过脂质体介导方法,将pEGFP-C1-WIF转染体外培养的HSC-T6细胞株,用TGF-β1刺激转染（试验组）和未转染的HSC-T6细胞株（对照组）,并用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组细胞（包括正常细胞组）smad3、β-连环蛋白（β-catenin）mRNA及其蛋白质的表达。结果试验组HSC-T6细胞株smad3、β-catenin mRNA及蛋白质表达明显低于正常组HSC-T6细胞株,更低于对照组HSC-T6细胞株（P〈0.05）。β-catenin和smad3蛋白质的表达均与α-肌动蛋白（α-SMA）蛋白质的表达显著相关（r=0.800,P〈0.01;r=0.743,P〈0.01）。结论 WIF能通过下调wnt/β-catenin以及TGF-β1/smads信号通路的生物学效应抑制HSC-T6细胞的活化,从而延缓肝纤维化的发展。     

苯肾上腺素对大鼠心肌纤维化的调节及其与转化生长因子-β1、果蝇母性DPP同源蛋白3及结缔组织生长因子信号通路的关系

目的:观察苯肾上腺素对压力超负荷介导的大鼠心肌纤维化(MF)的调节及其与转化生长因子-β1(TGF-β1)、果蝇母性DPP同源蛋白3(Smad3)及结缔组织生长因子(CTGF)信号通路的关系。方法:将雄性SD大鼠28只随机分为对照组、腹主动脉缩窄(AAC)组、AAC+苯肾上腺素组和AAC+哌唑嗪组,每组7只。通过心肌胶原形态学测定左心室组织胶原容积分数(CVF)观察大鼠MF的变化,应用免疫组化法检测各组大鼠左心室组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1、Smad3及CTGF表达,用蛋白免疫印迹(Western blot)法测定左心室组织α-SMA表达。结果:(1)心肌胶原形态学显示:与对照组比,AAC组、AAC+苯肾上腺素组和AAC+哌唑嗪组的CVF均明显升高(P均0.01);与AAC组比,AAC+苯肾上腺素组的CVF显著减少(P0.01)。(2)免疫组化法显示:与对照组比,AAC组、AAC+苯肾上腺素组和AAC+哌唑嗪组的α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表达均上调(P均0.01);与AAC组比,AAC+苯肾上腺素组的α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表达均降低(P均0.01)。(3)Western blot法显示:与对照组比,AAC组、AAC+苯肾上腺素组和AAC+哌唑嗪组的α-SMA表达均上调(P均0.05);与AAC组比,AAC+苯肾上腺素组的α-SMA表达降低(P0.01)。结论:苯肾上腺素可以改善压力超负荷诱导的大鼠MF,该作用可能与抑制TGF-β1/Smads信号通路及下调CTGF有关。     

转化生长因子βⅠ型受体基因的靶向小干扰RNA抑制肝星状细胞合成胶原的体外研究

目的 观察大鼠转化生长因子βⅠ型受体(TβR Ⅰ)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)表达质粒对肝星状细胞(HSC)合成胶原的影响.方法 根据大鼠Tβ R Ⅰ的基因序列,设计并构建3个大鼠TβR Ⅰ基因的靶向siRNA表达质粒,以脂质体作转染试剂,将siRNA表达质粒分别转染至HSC-T6细胞中,RT-PCR和Western印迹技术分析TβRⅠ mRNA及蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,放射免疫法测HA、PCⅢ含量.采用LSD法进行统计学处理.结果 酶切证实siRNA的目的 基因片段已成功克隆入载体中.与空白对照组比较,转染siRNA表达质粒后,3组HSC-T6细胞TβR Ⅰ mRNA表达水平均抑制,其中以psiRNA2组抑制作用最强(psiRNA1组:t=7.354,P＜0.01;psiRNA2组:t=9.214,P＜0.01;psiRNA3组:t=5.967,P＜0.01).3组TβRⅠ蛋白表达水平均降低,以psiRNA2组降低最明显(psiRNA1组:t=6.324,P＜0.01;psiRNA2组:t=8.741,P＜0.01;psiRNA3组:t=4.128,P＜0.01).3组HSC-T6细胞增殖活性均下降,合成胶原均减少,以psiRNA2组最明显;而转染无关siRNA组无明显变化.结论 构建的TβR Ⅰ siRNA表达质粒可抑制HSC-T6细胞合成胶原,为肝纤维化基因治疗提供新的靶点.     

活血软坚方对肝星状细胞Smad信号的影响及意义

目的 活血软坚方的成药制剂-和络舒肝含药血清对肝星状细胞(HSC)-T6细胞株Smad3、Smad17、前胶原α2(Ⅰ)基因表达影响,以探讨活血软坚方抗肝纤维化作用及分子机制。方法 常规方法制备和络舒肝含药血清。用不同浓度和络舒肝含药血清干预HSC-T6细胞株,并以逆转录聚合酶链反应观察分析各组间Smad3、Smad7、前胶原α2(Ⅰ)mRNA表达的变化,以western blot检测Smad3蛋白的表达。结果 经和络舒肝含药血清处理,可下调HSC-T6细胞株Smad3、前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达以及Smad3蛋白表达水平,前胶原α2(Ⅰ)表达变化与Smad3表达改变趋势一致。不同浓度的含药血清作用强度明显不同,药物作用后前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达改变呈现血药浓度依赖性(F=6.92,P<0.05)。药物血清对Smad7 mRNA表达影响不明显(F=1.57,P>0.05)。结论 活血软坚方和络舒肝的抗肝纤维化作用可能是通过非特异性作用干扰转化生长因子β和Smad功能,抑制前胶原α2(Ⅰ) mRNA转录,从而减少细胞外基质生成。对Smad3而言,可能其表达升高产生的是促纤维化形成效应,反之,表现为抗纤维化作用。     

肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化TGF-β_1/Smad信号通路的影响

目的观察肝豆扶木汤(GDFMT)对TX小鼠肝纤维化转化生长因子-β1(TGF-β_1)/Smad信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法将24只雄性TX小鼠随机分为模型组、青霉胺组、GDFMT组,另设正常对照组。采用竞争性放免分析法检测血清肝纤维化透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)含量,免疫组化法观察肝组织TGF-β_1、Smad2和Smad7蛋白的表达。结果血清肝纤维化指标结果:与正常对照组比较,模型组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均明显升高(P0.01);与模型组比较,青霉胺组和GDFMT组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P0.05或P0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P0.05)。免疫组化法观察结果:与正常对照组比较,模型组TGF-β_1和Smad2蛋白表达明显升高,Smad7蛋白表达明显降低(P0.01);与模型组比较,青霉胺组和GDFMT组TGF-β_1和Smad2蛋白表达明显降低(P0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组TGF-β_1和Smad2蛋白表达明显降低(P0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 GDFMT可以能降低TX小鼠肝纤维化血清学指标,具有良好的抗肝纤维化的作用,其作用机制可能是抑制TGF-β_1和Smad2蛋白的表达,上调Smad7蛋白的表达。     

转化生长因子-β1促进miR-181a表达诱导肝星状细胞-T6细胞活化

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对miR-181a表达的影响,以及miR-181a对体外培养的肝星状细胞(HSC)-T6细胞的作用。方法 TGF-β1处理HSC-T6细胞后,检测miR-181a和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。miR-181amimics转染HSC-T6细胞后,Western印迹检测α-SMA和Ⅰ型胶原a2链(collagenⅠa2,ColⅠA2)蛋白表达,CCK-8计数法检测细胞增殖。结果 TGF-β1处理组细胞中miR-181a和miR-181b表达量较对照组细胞明显升高,miR-181a转染组细胞中α-SMA和ColIA2表达量明显高于对照组细胞,miR-181a对HSC-T6增殖无明显影响。结论在HSC-T6中,TGF-β1促进miR-181a表达,miR-181a可促进HSC-T6细胞活化和分泌胶原,进一步明确了TGF-β1促进HSC-T6活化的机制。     

Ang(1-7)对AngⅡ诱导的肝星状细胞Mas受体、TGF-β1/Smad3、CTGF的影响

目的体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),观察血管紧张素(1-7)(Ang1-7)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肝星状细胞Mas受体、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、结缔组织生长因子(CTGF)表达情况的影响,进而探讨Ang(1-7)在肝纤维化进程中的作用及可能的作用机制,为临床治疗肝纤维化提供理论依据。方法体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),分为正常对照组、不同浓度AngⅡ处理组、AngⅡ+Ang(1-7)组、AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组。培养24 h后,流式细胞仪(Annexin V/PI)双染法检测各组细胞凋亡率;同时采用Real-time PCR及Western Blotting检测肝星状细胞中Mas受体、TGF-β1、Smad3及CTGF mRNA及蛋白的表达。结果 (1)与正常对照组相比,AngⅡ处理组肝星状细胞凋亡活性增加,TGF-β1、Smad3、CTGF、Mas受体mRNA及蛋白表达量较正常对照组增加(P0.05)。(2)与AngⅡ处理组相比,AngⅡ+Ang(1-7)组肝星状细胞的凋亡率增加,而TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低,Mas受体表达增加(P0.05)。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞的凋亡率、TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低(P0.05),Mas受体表达增加(P0.05)。结论 (1)AngⅡ可诱导大鼠肝星状细胞活化,促使TGF-β1、Smad3、CTGF表达增加。(2)Ang(1-7)可促使AngⅡ诱导的肝星状细胞凋亡而发挥抗肝纤维化作用。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞凋亡率、Mas受体表达下降(P0.05),TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达增加(P0.05)。     

银杏叶提取物对大鼠肝星状细胞细胞因子和胶原合成及细胞增殖的影响

目的研究银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机理。方法用不同浓度(0,1,10,100,500μg·ml-1)的银杏叶提取物处理HSC-T6细胞24h和48h,采用RT-PCR法检测各组细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达;应用流式细胞仪检测细胞增殖周期的变化。结果银杏叶提取物在10,100,500μg·ml-1浓度能明显抑制TGF-β1、CTGF、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达(P<0.01或P<0.05),在一定范围内呈剂量和时间依赖性,影响HSC-T6的细胞周期,降低其增殖活性。结论银杏叶提取物可明显抑制HSC-T6细胞的增殖,抑制细胞因子及细胞外基质成分基因的表达,由此发挥抗肝纤维化的作用。     

骨成形蛋白7对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用

目的 研究骨成形蛋白7 (BMP7)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用.方法 体外培养HSC-T6细胞,分为对照组、TGFβ1组、TGFβ1+ BMP7组和TGFβ1+ BMP7+ Noggin组.RT-PCR法检测果蝇蛋白质1(smad1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、gremlin和纤维连接蛋白(FN)mRNA的表达,Western印迹法检测磷酸化smad1/5/8(P-smad1/5/8)、α-SMA、gremlin蛋白的表达.采用单因素方差分析、LSD检验、Dunnett T3检验和Pearson直线相关分析进行统计学处理.结果 对照组HSC-T6细胞中可见P-smad1/5/8、α-SMA、gremlin及FN的表达,TGFβ1刺激后表达量明显增加,差异有统计学意义(均P＜0.05).与TGFβ1组比较,TGFβ1+ BMP7组α-SMA、gremlin及FN表达下调,但P-smad1/5/8蛋白表达增加(1.613±0.031比2.503±0.014;t=34.89,P＜0.05).TGFβ1+ BMP7+ Noggin组α-SMA、gremlin及FN表达较TGFβ1+ BMP7组增加,而P-smad1/5/8蛋白表达下调(t=34.05,P＜0.05).smadl mRNA在各组表达均无显著变化.结论 BMP7对α-SMA、gremlin和FN均有较强的抑制作用.     

TGF-β1、Smad7在老年星形细胞瘤患者术后组织中的表达及其相关性

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1、Smad7在老年星形细胞瘤患者术后组织中的表达及其相关性。方法接受手术治疗的老年星形细胞瘤患者25例为研究组。取术中切除的星形细胞瘤组织标本,分为低级别(Ⅰ~Ⅱ级)11例,高级别(Ⅲ~Ⅳ级)14例;另收集本院行内减压术切除的额颞叶正常脑组织6例为对照组。免疫组化染色检测TGF-β1、Smad7在星形细胞瘤及正常脑组织中的表达,RT-PCR检测TGF-β1、Smad7mRNA表达水平。结果 TGF-β1、Smad7主要表达于正常脑组织和星形细胞瘤组织的细胞质,为黄色或棕黄色颗粒,细胞膜和细胞核均无明显阳性表达;各组间TGF-β1、Smad7表达水平差异均有显著统计学意义(P<0.01),TGF-β1、Smad7的阳性表达率由高到低依次为:高级别星形细胞瘤、低级别星形细胞瘤、正常脑组织,TGF-β1与Smad7之间呈明显正相关。正常脑组织、低级别星形细胞瘤、高级别星形细胞瘤中TGF-β1 mRNA和Smad7mRNA表达量逐渐增加,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β1、Smad7表达与老年星形细胞瘤的病理分级呈正相关,TGF-β1/Smad信号通路参与了星形细胞瘤的异常增殖。     

低密度脂蛋白诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用机制研究

目的探讨低密度脂蛋白(LDL)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化的影响及其作用机制。方法将体外培养的NRK-52E细胞分为4组:正常对照组、洛伐他汀(Lov,1μmol/L)组、LDL(250 mg/L)刺激组、LDL(250mg/L)+Lov(1μmol/L)组。应用倒置显微镜观察细胞形态学改变;RT-PCR检测NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3和整合素链接酶(ILK)mRNA表达;West-ern blot检测α-SMA、E-cadherin及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表达;ELISA检测上清液TGF-β1。结果加入LDL培养24 h后,NRK-52E细胞由立方形或多角形变为长梭形,α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3和ILK mRNA的表达上调,E-cadherin mRNA的表达下调,与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);α-SMA和p-Smad2/3蛋白表达量显著高于对照组(P0.01),E-cadherin蛋白表达量显著低于对照组(P0.01);细胞上清液TGF-β1浓度显著高于对照组(P0.01)。LDL+Lov组与LDL组比较,NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、ILK mRNA的表达及α-SMA、p-Smad2/3的蛋白表达均明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达明显增强。结论LDL可诱导肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是激活TGF-β1/Smads/ILK信号通路,而Lov能部分阻断LDL诱导的小管上皮细胞转分化。     

调控Notch信号对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC-T6)内是否存在功能激活的Notch信号分子以及调控Notch信号转导对HSC-T6活化的影响. 方法 用PCR方法检测Notch信号分子mRNA在HSC-T6细胞内的表达,TaqMan探针检测转化生长因子(TGF)β 1刺激HSC-T6后Notch信号分子的表达变化.细胞免疫荧光法检测Notch3和Jagged1在HSC-T6内的表达定位.用携带Notch3胞内域(ICD)的真核表达质粒pcDNA3.1-N3ICD和特异性干扰Notch3的siRNA(Notch3-siRNA)分别转染HSC-T6细胞,Western blot检测Notch3、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅰ型胶原的表达变化.对数据采用t检验和方差分析. 结果 HSC-T6细胞内存在功能激活的Notch信号转导.TGF β 1(2.0 ng/ml)刺激HSC-T6导致Jagged1、Notch3和HES-1的mRNA水平明显上调,分别提高了2.9、3.2、2.2倍,F值分别为2543.482,287.982和1719.851,P值均＜0.01.pcDNA3.1-N3ICD转染后促使HSC-T6合成α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白增加,较对照组分别提高了5.8倍和4.5倍,t值分别为13.157和9.810,P值均＜0.01;相反,Notch3- siRNA明显抑制HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,较对照组分别下降了约90％和84％,t值分别为19.863和10.376,P值均＜0.01.而且,Notch3-siRNA能拮抗TGFβ1诱导HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原的作用.结论 Notch信号通路可能通过调控肝星状细胞的活化参与肝纤维化的形成,选择性地干预Notch3信号转导可能成为抗肝纤维化的新途径.     

四甲基吡嗪对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1、Smad3、Smad7及瘦素表达的影响

目的 观察肝组织中TGF-β1、Smad3、Smad7和瘦素(Leptin)表达的变化,研究四甲基吡嗪抗肝纤维化作用及可能机制.方法 SD大鼠48只,随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、四甲基吡嗪预防组、四甲基吡嗪治疗组、葡萄糖预防组、葡萄糖治疗组.除正常对照组外,其余各组大鼠均皮下注射60%四氯化碳(0.3 mL/100 g体重,每周2次)复制肝硬化动物模型.四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组分别自造模之日起和造模开始后第31天给予四甲基吡嗪(10 mg/100 g体重灌胃,1次/d),葡萄糖预防组和葡萄糖治疗组分别于造模之日起和造模开始后第31天予5%葡萄糖(1 mL/100 g体重,1次/d)灌胃作平行对照.实验第12周取肝组织,用RT-PCR检测肝组织中瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βRⅡ的mRNA表达水平,用Western blot检测肝组织中Smad3、Smad7的蛋白水平,MPIAS-500多媒体真彩色图像分析系统作肝内胶原定量分析.结果 与正常组大鼠相比,模型组大鼠肝内胶原面积、肝组织中瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βRⅡ的mRNA表达及Smad3蛋白增高,Smad7蛋白降低(P<0.01),四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组上述指标高于正常组大鼠,但均低于模型组大鼠(P<0.05,P<0.01);四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组Smad7蛋白水平高于模型组(P<0.05),但低于正常组大鼠.结论 四甲基吡嗪能有效减轻四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化作用,可能与直接或间接下调肝内瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βRⅡ及Smad3表达,上调Smad7表达有关.     

氧化苦参碱对转化生长因子-β1促肝星状细胞活化及跨膜信号转导影响

目的观察低浓度氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞(HSC)培养活化和转化生长因子-β1,(TGF-β1)促活化作用影响,并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系.方法原代分离培养2d HSC,MTT法检测低浓度氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSG细胞毒作用(作用12 h)和增殖影响(作用48 h),或给予TGF-β1(5 ng/m1)和/(或)氧化苦参碱(2 mg/L)干预,相差显微镜观察HSC形态变化,分别以RT-PCR或Western blot法检测TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 2/3、Smad 7以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和/(或)蛋白表达.结果氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSC无明显细胞毒作用,大于8 mg/L能抑制HSC增殖.氧化苦参碱(2 mg/L)抑制TGF-β1诱导HSC激活时的α-SMA表达和形态转化,伴随TGF-β1受体mRNA表达升高,Smad 7 mRNA表达上调及TGF-β1mRNA表达下降(与单纯TGF-β1处理组相比,分别上升1.25、0.87倍或下降1.92倍,P均＜0.05),但不影响TGF-β1Ⅱ型受体和Smad 3 mR-NA表达.Western blot检测Smad 2/3、Smad 7蛋白表达,与RT-PCR结果相似.氧化苦参碱对单纯培养激活的HSC有类似作用.结论低浓度氧化苦参碱(2 mg/L)上调Smad 7表达并抑制TGF-β1表达、上调TGF-β1Ⅰ型受体、恢复正常的TGF-β1跨膜信号转导,抑制HSC培养活化和TGF-β1促活化作用.