miR-129-5p靶向LARP1基因调控肺癌细胞顺铂耐药

【摘要】 目的 探讨miR-129-5p能否通过调控La相关蛋白1（LARP1）表达,从而调节肺癌细胞对顺铂（DDP）的敏感性。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印记（Western blot）检测肺癌细胞A549和肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP中miR-129-5p、LARP1以及多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达水平。将A549/DDP分为对照组（NC）、miR-con组、miR-129-5p组、si-con组和si-LARP1组、miR-129-5p+pcDNA-con组、miR-129-5p+ pcDNA-LARP1组。细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率和对顺铂的半数抑制浓度（IC50）。Western blot检测细胞周期蛋白D1（CyclinD1）和MRP1蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测验证miR-129-5p和LARP1的靶向调控关系。结果 与A549细胞相比,A549/DDP细胞中miR-129-5p的表达水平降低,LARP1和MRP1的表达水平升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与miR-con组比较,miR-129-5p组A549/DDP细胞存活率、IC50、CyclinD1和MRP1蛋白表达均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与si-con组比较,si-LARP1组A549/DDP细胞存活率、IC50降低,CyclinD1和MRP1蛋白表达降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与miR-129-5p+pcDNA-con组比较,miR-129-5p+- pcDNA LARP1组A549/DDP细胞存活率、IC50升高,CyclinD1和MRP1蛋白表达升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。LARP1是miR-129-5p的靶基因。过表达miR-129-5p后LARP1蛋白表达降低,沉默miR-129-5p后LARP1蛋白表达升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 miR-129-5p通过靶向下调LARP1表达抑制肺癌细胞增殖,提高肺癌细胞的顺铂敏感性。     

P5增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的体外研究

目的:探讨凋亡诱导核苷P5增强卵巢癌细胞顺铂(DDP)敏感性的作用,为临床改善卵巢癌患者的预后提供新方法.方法:选择卵巢癌细胞株COC1,以MTT法、Hoechst染色法,观察P5对卵巢癌细胞的生长抑制作用及其对DDP化疗的增敏作用.结果:小剂量P5(25 μg/mL)和大剂量P5(200 μg/mL)分别联合DDP共同作用于COC1细胞,DDP IC50值由2.51 μg/mL降至1.56～1.52 μg/mL.Hoechst染色法观察,小剂量P5和大剂量P5联合DDP作用于COC1细胞株,细胞凋亡明显增加.结论:小剂量P5与大剂量P5均能增加COC1细胞对DDP的敏感性,P5 DDP化疗增敏作用与其增加肿瘤细胞凋亡有关.     

小剂量顺铂连续化疗对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性影响的体外研究

目的以小剂量顺铂连续化疗模拟节律化疗方式,采用细胞培养方法研究此种给药方式对鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE-1细胞放射敏感性的影响,为临床鼻咽癌同步放化疗探索一种新的高效低毒的治疗模式。方法 MTT方法检测顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞的半抑制浓度(IC50),1/5IC50为小剂量化疗参考剂量,而IC70则为MTD化疗参考剂量。细胞分4组进行如下处理:A组剂量为1/5IC50的顺铂连续作用96h后进行放疗;B组剂量为IC70的顺铂连续作用3h后立即给予放疗;C组为IC70作用3h后间隔93 h进行放疗;D组为未加入顺铂化疗的鼻咽癌细胞株同样条件下培养96h后进行放疗。克隆形成实验计算细胞存活率,采用单击多靶模型绘制剂量存活曲线,比较各处理组辐射敏感性变化。结果顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞株作用72h的IC50值为0.26μg/ml,1/5IC50为0.05μg/ml,IC70为0.72μg/ml。采用单击多靶模型计算各处理组的SF2值与SER值如下:A组SF2为(0.414±0.008),SER值为(1.429±0.110);B组SF2值为(0.502±0.010),SER值为(1.012±0.129);C组SF2值为(0.411±0.014),SER值为(1.400±0.169);D组SF2为(0.603±0.100)。结论采用类似节律化疗方式给药,与放疗联用可以引起CNE-1细胞株放射敏感性增高。     

bcl-2硫代反义寡核苷酸增强膀胱癌细胞对顺铂的敏感性

目的　研究凋亡抑制基因bcl 2硫代反义寡核苷酸 (S ODN)转染T2 4细胞后对顺铂药物敏感性影响。方法　将培养细胞分为 6组 :反义S ODN组 ,正义S ODN组 ,反义S ODN +顺铂组 ,正义S ODN +顺铂组 ,顺铂组和对照组。应用脂质体法介导bcl 2正义、反义S ODN转染T2 4细胞。通过免疫细胞化学方法观察细胞内BCL 2的蛋白表达 ,RT PCR方法检测细胞内bcl 2mR NA的相对表达量 ,MTT法测经顺铂 (cis platinum)处理的各组细胞的生成率 ,流式细胞仪 (FCM)检测细胞凋亡率。结果　bcl 2反义S ODN处理过的T2 4细胞中BCL 2蛋白和bcl 2mRNA表达明显下降。顺铂对反义S ODN组细胞的半抑制浓度 (IC50 )为 (2 .2 5± 0 .0 9) μg/ml显著低于正义S ODN组 (5 .83± 0 .15 ) μg/ml和对照组 (6 .11± 0 .2 1) μg/ml(P <0 .0 1)。顺铂处理反义S ODN组细胞的凋亡率显著高于其它组。结论　bcl 2反义S ODN能显著抑制T2 4细胞中BCL 2蛋白的表达并增强T2 4细胞对顺铂的药物敏感性     

转染GML基因提高肺癌A549细胞对顺铂杀伤的敏感性

目的 探讨转染GML基因对顺铂杀伤肺癌A549细胞敏感性的影响.方法 应用脂质体将GML基因稳定转染入肺癌A549细胞.应用RT-PCR测定GML基因的表达.应用MTT法测定GML基因对于A549生长的影响,以及不同浓度顺铂对细胞的杀伤率,以此计算出顾铂杀伤细胞的IC50.结果 RT-PCR结果显示,在GML基因转染的A549细胞有GML基因的表达,而在转染对照质粒以及正常A549细胞未见GML基因的表达.转染GML基因的A549细胞生长数目明显低于未转染组.顺铂对于转染GML基因的A549细胞杀伤效率明显高于未转染组,转染GML基因细胞与为未转染基因细胞相比其IC50降低4倍.结论 转染GML基因可以显著提高肺癌A549细胞对顺铂的敏感性.     

黄芩素通过SIRT1/p53途径提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性

目的: 探讨中药活性成分黄芩素是否对顺铂有协同抗宫颈癌效应并研究其机制。方法: MTT实验检测宫颈癌细胞系Hela的细胞活力;流式细胞术检测Hela细胞的凋亡;western blot实验检测Hela细胞中SIRT1、p53、乙酰化p53、Puma的表达水平及caspase-3的活化水平。结果: 顺铂联合黄芩素对Hela的细胞活力抑制率(66.3±5.7)和凋亡诱导率(38.4±3.2)显著高于顺铂单治疗组的的细胞活力抑制率(18.1±1.4,P<0.05)和凋亡诱导率(10.4±0.9,P<0.05)。顺铂联合黄芩素治疗组的SIRT1表达水平显著低于顺铂单治疗组,同时顺铂联合黄芩素治疗组的p53乙酰化水平和表达水平、Puma表达水平及caspase-3活化水平均显著高于顺铂单治疗组。另外,顺铂+黄芩素+SIRT1质粒组Hela的细胞活力抑制率(25.7±2.1)和凋亡诱导率(14.5±1.1)显著低于顺铂联合黄芩素组Hela的细胞活力抑制率(66.3±5.7,P<0.05)和凋亡诱导率(38.4±3.2,P<0.05)。结论: 黄芩素通过SIRT1/p53途径增强顺铂对宫颈癌细胞的杀伤活性。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的 探索Ｐ１６基因在脑胶质瘤生发展过程中的作用及其与脑胶细胞顺铂化疗敏感性关系。方法 采用脂质体转染的方法，将外源墅生型Ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２６１，观察Ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤的作用，并筛选阳性克隆。同时以空本质粒ＰＣＤＮＡ３为对照，免疫组化Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测Ｐ１６基因表达，对后细胞生长情况，细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｏｒｏｐｌａｔｉｕｍ，ＣＤＤＰ     

p38δ对宫颈癌HeLa细胞顺铂敏感性的影响

【摘要】 目的 探讨p38δ对HeLa细胞顺铂敏感性的影响。方法 采用细胞转染方法在HeLa细胞中过表达p38δ蛋白;采用Annexin V FITC/PI双染色检测细胞凋亡水平;采用蛋白质印迹法检测蛋白表达水平;采用免疫沉淀法纯化p38δ蛋白,并采用蛋白质印迹法检测其磷酸化水平。结果 与转染对照质粒HeLa细胞相比,转染p38δ表达质粒HeLa细胞在正常培养条件下和顺铂处理条件下的细胞凋亡水平都显著上升（P均＜001）。在顺铂处理条件下,与转染对照质粒HeLa细胞相比,转染p38δ表达质粒HeLa细胞Bcl 2蛋白表达水平下降,Bax和p53蛋白表达水平上升（P均＜001）。顺铂处理HeLa细胞中p38δ磷酸化水平显著上升（P＜001）。与转染野生型p38δ（WT）HeLa细胞相比,转染激酶失活突变体p38δ（K54R）HeLa细胞在正常培养条件下和顺铂处理条件下的细胞凋亡水平都显著下降（P均＜001）。结论 p38δ促进HeLa细胞凋亡并增强其对顺铂的敏感性,且p38δ对HeLa细胞凋亡的调控依赖于其蛋白激酶活性。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１,观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达,对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ,ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长,克隆形成率减少,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞,同时,细胞对顺铂的敏感性降低,化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。     

RAD18基因敲除增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的:研究敲除E3泛素连接酶RAD18基因后,人肺腺癌A549细胞株和顺铂耐药A549(A549/DDP)细胞株FA/BRCA途径DNA修复功能的变化及其对顺铂敏感性的改变。方法:合成针对RAD18基因的siRNA(RAD18-siRNA),通过脂质体将其分别转染人A549和A549/DDP细胞株。蛋白质印迹法检测经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后RAD18蛋白表达及FANCD2单泛素化水平;CCK-8法测定经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后细胞增殖率的变化;免疫荧光测定胞核内FANCD2核聚小体的形成;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后细胞凋亡率。结果:与转染RAD18-siRNA前相比,转染后经顺铂处理的A549和A549/DDP细胞株RAD18表达均明显降低;FANCD2蛋白单泛素化水平下调和核聚小体形成减少;同时细胞增殖率明显降低,细胞凋亡率则明显增加。结论:应用RNA干扰技术敲除RAD18基因可通过抑制A549和A549/DDP细胞株FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能,增加这两种细胞株对顺铂的敏感性。     

乳酸菌培养上清液下调Piwil2基因增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨乳酸菌培养上清液(lactobacilli supernatants,LS)处理乳腺癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的影响及其机制.方法 采用CCK-8和Western blot检测不同浓度DDP(0、1、2、3、4、5 μg/mL)和LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和Piwil2基因表达的影响;瞬时转染Piwil2 siRNA沉默MDA-MB-231细胞中Piwil2基因表达,Westernblot检测其沉默效果,CCK-8检测Piwil2基因沉默后对MDA-MB-231细胞增殖的影响;2μg/mL DDP联合不同浓度LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)作用MDA-MB-231细胞,观察细胞增殖抑制效应和Piwil2蛋白表达的改变.结果 高浓度DDP(≥3μg/mL)可抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.05),而低浓度DDP(≤2 μg/mL)不能有效抑制细胞增殖;DDP以剂量依赖性方式上调Piwil2蛋白的表达;siRNA沉默Piwil2表达可恢复2μg/mL DDP对细胞增殖的抑制.与对照组(乳酸菌培养基,MRS)比较,LS以剂量依赖性方式下调Piwil2蛋白的表达,但并不影响细胞的增殖;与单用2μg/mLDDP比较,2μg/mL DDP联合20％ LS处理可显著下调Piwil2蛋白的表达并抑制细胞增殖(P＜0.05).结论三阴性乳腺癌细胞中Piwil2的高表达可导致细胞对顺铂敏感性的降低,乳酸菌培养上清液可通过下调PiwiL2基因的表达增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性.     

miRNA-21-5p通过pdcd4靶向调控胃癌细胞对顺铂敏感性的机制研究

目的:探究微小RNA-21-5p（miRNA-21-5p）通过下调pdcd4基因表达调控胃癌耐药细胞系SGC-7901/DDP对顺铂敏感性机制的研究。方法:采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度的顺铂（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）对胃癌细胞系SGC7901及胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP增殖抑制的影响。通过实时荧光定量PCR检测SGC7901/DDP细胞中瞬时转染miRNA-21-5p inhibitors后miRNA-21-5p相对表达量的变化。采用Western blot及实时荧光定量PCR检测转染组、无关序列转染组（NC组）及空白转染组（CON组）分别转染miRNA-21-5p inhibitors及无关序列后对靶基因pdcd4蛋白及mRNA表达量的影响。结果:MTT实验结果显示耐药细胞SGC7901/DDP相对于亲本细胞SGC7901对顺铂不敏感（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果表明,转染组miRNA-21-5p表达量均明显低于NC组和CON组（P<0.01）,转染组pdcd4 mRNA表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。Western blot检测结果示,转染组pdcd4蛋白表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。结论:miRNA-21-5p表达水平的升高在一定程度上有利于胃癌细胞增殖,并通过下调pdcd4的表达,降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。     

ALDH1A2基因过表达对结肠癌移植瘤生长的影响

目的:采用转染的细胞构建裸鼠移植瘤,研究ALDH1A2过表达对异种移植瘤的影响。方法:利用不同组别的LOVO细胞接种裸鼠构建移植瘤模型,观察成瘤时间、瘤体平均体积,平均瘤重,探讨ALDH1A2在体内对结肠癌的影响。结果:ALDH1A2组及ATRA组裸鼠成瘤时间较对照组有显著延长,瘤体体积较对照组显著减少,瘤重也较对照组显著减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功地建立了人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型,AL-DH1A2组裸鼠成瘤时间短,瘤重低,ALDH1A2过表达可抑制LOVO细胞的增殖。     

丹参酮Ⅱ A联合顺铂对Hela细胞生长及p53蛋白表达水平的影响

目的:研究丹参酮Ⅱ A联合顺铂在体外对宫颈癌Hela细胞生长的影响及细胞中p53蛋白表达水平的变化。方法:采用MTT法测定丹参酮Ⅱ A联合顺铂对Hela细胞增殖的影响;HE染色法观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测药物作用后的细胞凋亡情况;Western Blot测定p53蛋白水平的表达。结果:丹参酮ⅡA联合顺铂用药组比同等剂量的两药单用组及对照组对Hela细胞的增殖抑制率高(P<0.05);对照组细胞未见凋亡,而两药单用组及联合组均可见细胞凋亡;药物处理组均可检测到细胞亚G1峰,两药联合组细胞亚G1峰与单药组差异显著;在只含溶媒组、丹参酮Ⅱ A组、顺铂组及丹参酮Ⅱ A联合顺铂组中p53蛋白水平表达逐步升高。结论:丹参酮Ⅱ A联合顺铂比两药单用能显著抑制Hela细胞的生长;二者通过增加p53蛋白的表达,促进细胞凋亡。     

干扰TRIAP1表达增强口腔鳞状细胞癌细胞对顺铂敏感性实验研究

目的:探讨肿瘤蛋白53调控的细胞凋亡抑制剂1(TRIAP1)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞顺铂(DDP)敏感性的影响及作用机制。方法:常规培养OSCC细胞系Cal-27细胞,采用分次DDP诱导递增法建立DDP耐药OSCC细胞株(DDP-Cal-27),MTS检测DDP-Cal-27细胞对DDP的敏感性,Western blot检测DDP-Cal-27细胞中TRIAP1的表达。并采用TRIAP1干扰慢病毒构建TRIAP1敲低的DDP耐药OSCC细胞株(sh-TRIAP1)及对照无关序列感染的DDP耐药OSCC细胞株(sh-NC),Western blot检测sh-TRIAP1细胞中TRIAP1的表达,MTS检测sh-TRIAP1细胞对DDP的敏感性。sh-NC组和sh-TRIAP1组细胞经DDP处理后,平板克隆检测各组细胞平板克隆形成能力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞中凋亡蛋白Caspase 9和Caspase 3蛋白的表达,耐药相关蛋白P-gp和ABCG2的表达。结果:与Cal-27细胞相比,DDP-Cal-27细胞对DDP的敏感性降低,DDP-...     

CKMT1A对人鼻咽癌HONE1细胞铂类化疗药物敏感性的影响及机制研究

近年来鼻咽癌患者五年生存率的提升难度明显增加,对铂类化疗药物的敏感性较差是主要原因,探讨耐药机制具有重要意义。本研究将鼻咽癌细胞转染分为空载体对照组(空载体质粒)、线粒体肌酸激酶1A(CKMT1A)过表达组(CKMT1A过表达载体质粒),分别进行MTT法检测、流式细胞术检测、实时荧光定量PCR检测和Western blot检测。结果显示随着顺铂浓度的增加,CKMT1A过表达组吸光度值下降幅度更明显(P<0.01)。根据顺铂IC₅₀结果选取2 μmol/L顺铂处理细胞24 h后,两组细胞均表现为G0/G1期比例明显下降,S期和G2/M期比例明显增多。2 μmol/L顺铂处理细胞48 h后,CKMT1A过表达组细胞凋亡率明显高于空载体对照组(P<0.01);CKMT1A过表达组c-PARP、Bax相对表达量明显高于空载体对照组,BCL-2相对表达量明显低于空载体对照组(P<0.05)。2 μmol/L顺铂处理细胞6 h后, CKMT1A过表达组p-STAT3相对表达量明显高于空载体对照组(P<0.01)。过表达CKMT1A可通过细胞凋亡信号通路下调STAT3磷酸化水平,抑制靶基因表达,促进人鼻咽癌细胞株HONE1凋亡,提升对铂类化疗药物的敏感性。     

SIRT1基因沉默对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响

目的 探究SIRT1基因沉默对人鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响,为鼻咽癌临床治疗提供新的思路.方法 通过Western blot检测鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中SIRT1蛋白的表达情况.通过脂质体转染SIRT1 siRNA至CNE-1细胞;利用CCK-8法和流式细胞术检测不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)的X射线放...