中华眼镜蛇毒活性组分抑制内皮细胞增殖及其机制探讨

目的 观察中华眼镜蛇毒活性组分(China cobra venom active factor,CCVAF)对新生牛肺主动脉血管内皮细胞增殖的抑制作用,并探讨其抑制细胞增殖的胞内机制.方法 采用胰酶消化法体外培养新生牛肺主动脉血管内皮细胞,将不同浓度的CCVAF与细胞在高血清、VEGF条件下共孵育,应用MTT法检测细胞增殖,免疫组化方法检测各组c-myc,c-fos,PCNA表达.结果 CCVAF终浓度为1.25,2.5,5.0μg/ml,对常规培养的细胞增殖抑制率分别为22%,54%,83%,对VEGF诱导的体外培养的细胞增殖抑制率分别为18%,39%,72%,对高血清诱导的细胞增殖抑制率分别为20%,44%,79%;CCVAF终浓度为2.5μg/ml,c-myc,c-fos及PCNA阳性细胞标记指数比对照组分别降低89.7%,47.1%及88.O%.结论 CCVAF可抑制常规培养的、VEGF及高血清诱导的新生牛肺主动脉血管内皮细胞增殖,这种抑制作用呈剂量依赖性;抑制胞内c-myc,c-fos,PCNA的表达可能是其抑制细胞增殖的机制之一.CCVAF抑制血管内皮细胞增殖作用可能在抗血管生成方面具有重要意义.     

海参皂苷Echinoside A通过MMP-9信号通路抑制肿瘤转移

从富含海参皂苷的革皮氏海参中分离纯化出Echinoside A（EA）,并研究了其抗肿瘤细胞转移活性及其作用机制。通过MTT法检测了EA对肿瘤细胞(HepG2)和人脐静脉内皮细胞生长的影响;采用细胞黏附实验、划痕愈合实验和Transwell小室侵袭模型研究了EA对肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响;采用体外小管形成实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM )血管新生模型研究了EA对血管新生的影响。实验结果表明：EA能显著抑制肿瘤细胞和内皮细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和黏附能力,显著抑制 CAM 新生血管生成作用。免疫细胞化学和Western-blotting实验表明,EA能显著下调MMP-9和VEGF的蛋白表达,提高TIMP-1的表达,但是对NF-κB p65的表达无显著性影响;提示EA具有显著的抑制肿瘤转移作用,其作用机制可能是通过MMP-9信号通路并进一步抑制血管内皮生长因子的蛋白表达实现。     

中华眼镜蛇毒纤溶组份的纤溶活性及其机制研究

目的：研究中华眼镜蛇（NajaNajaatra）蛇毒中单一纤溶活性组份对人纤维蛋白和纤维蛋白原的降解作用及其机制。方法：使用剩余可凝纤维蛋白原测定法和酶联纤维蛋白原溶解试验研究该纤溶活性组份对人纤维蛋白原的降解作用；使用纤维蛋白平板法和酶联纤维蛋白溶解试验研究它对人纤维蛋白的降解作用；对它的纤溶机制研究使用的是纤维蛋白溶解酶原激活物活性测定法。结果：该活性组分对人纤维蛋白和纤维蛋白原有直接的降解作用。其活性大约是粗毒的10倍。该活性组份仅降解纤维蛋白原的Aa链，对它的印链和了链没有作用。该组分对人纤维蛋白溶解酶原没有激活作用。结论：从中华眼镜蛇毒中提取的单一纤溶活性组分是一种新的能够直接降解人纤维蛋白和纤维蛋白原的酶类。     

中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞的增殖抑制和Fas/FasL表达的影响

目的 探讨中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞株的抑制作用及Fas/FasL表达的影响.方法 用MTT比色法检测不同浓度中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对HO-8910细胞的增殖抑制,RT-PCR和免疫组织化学观察原癌基因Fas/FasL表达的变化.结果 中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对HO-8910细胞增殖抑制作用成剂量依赖性,RT-PCR和免疫组化结果显示,随着中华眼镜蛇毒抗瘤多肽作用剂量的增加,Fas/FasL基因的表达无明显变化.结论 中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞系的增殖具有明显的抑制作用,并对原癌基因Fas/FasL的表达无抑制作用.     

中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL-7402细胞凋亡及端粒酶活性的影响

目的 :研究中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2细胞凋亡和端粒酶活性的影响 ,以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法 :用不同浓度的中华眼镜蛇毒组分C分别处理人肝癌细胞株BEL 74 0 2 ,采用MTT法、流式细胞仪法、TRAP -ELISA、透射电镜等观察其对肝癌细胞的细胞毒、细胞凋亡、细胞周期及端粒酶活性的影响。结果 :中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2有明显的抑制作用 ,且呈时间依赖性及剂量依赖性。用流式细胞仪分析发现中华眼镜蛇毒组分C可诱导BEL 74 0 2肝癌细胞发生凋亡 ,肝癌细胞明显阻滞于G0 /G1 期 ,在G1 峰前出现明显的亚二倍体凋亡峰 ,且其凋亡率随蛇毒浓度的升高而呈上升的趋势。用TRAP ELISA法同步测得蛇毒作用BEL 74 0 2肝癌细胞 8h后的端粒酶活性值明显下降 ,其抑制作用与剂量呈正相关 (r =0 .96 4 ,P <0 0 5 )。在电镜下 ,可观察到肝癌细胞出现明显的凋亡特征性改变 :细胞膜完整、核染色质固缩 ,核碎裂、凋亡小体形成。结论 :中华眼镜蛇毒组分C可显著抑制人肝癌细胞株 (BEL 74 0 2 )的增殖 ,在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时也下调瘤细胞的端粒酶活性 ,这可能是FC抗肿瘤的重要机制之一。     

转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响

目的　将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞 ,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用。方法　将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞 ,筛选阳性克隆 ,同时设空质粒组及PC3细胞为对照。采用RT PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法 ,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况 ,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况。结果　人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达 ,能抑制ECV30 4血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用。结论　成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白 ,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用 ,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础。     

YAP介导的力学信号转导在血管生成中的研究进展

皮肤组织工程支架中内皮细胞所感知的机械力是调控其黏附、迁移、血管生成等生物学行为的重要因素。从细胞感知外界力学刺激到基因转录水平发生变化的过程中,细胞骨架和Yes相关蛋白(YAP)发挥重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的主要驱动因素,其作用于VEGF受体后能诱导细胞骨架重构并激活YAP的协同转录功能。破坏细胞骨架结构或降低YAP活性可抑制VEGF促进血管生成的作用。因此,细胞骨架和YAP所介导的力学信号转导是血管生成过程中必不可少的调控因素。理解力学信号转导调控内皮细胞形成血管的作用和机制,有助于推动人工支架在皮肤软组织缺损治疗中的应用和发展。     

原核表达的血管抑素K (1-3)蛋白对脑胶质瘤的生长抑制作用

目的获得具有抗血管生成活性的 angiostatin K(1-3)[AK(1-3)]基因的原核表达蛋白,应用该蛋白治疗裸鼠皮下人脑胶质瘤.方法构建和鉴定 pDH-AK(1-3)载体并在大肠杆菌DH5α内表达,诱导后用 SDS-PAGE分析、经亲和层析纯化后行Western Blot鉴定,以人脐带静脉血管内皮细胞抑制实验和鸡胚绒毛膜尿囊膜实验验证其生物学活性,应用AK (1-3) 蛋白治疗裸鼠皮下人脑胶质瘤.结果获得抑制人脐带静脉血管内皮细胞生长活性的AK(1-3) 原核表达蛋白(Mr为35×103),其蛋白总量占菌体总蛋白的12 %,该纯化表达蛋白5 mg·kg-1·次-1和10 mg·kg-1·次-1组均可抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长,抑瘤率分别为34.5%和64.6%.结论该实验为应用抗血管生成药物治疗人脑胶质瘤等实体瘤研究奠定了初步基础.     

精芪双参胶囊组分对过氧化氢损伤血管内皮细胞保护作用

目的筛选精芪双参胶囊在保护血管内皮细胞损伤方面的药效物质活性组分。方法利用反相C18分离精芪双参胶囊各组分,采用H2O2诱导HUVECs细胞损伤模型,筛选精芪双参胶囊各组分的活性组分。结果二萜醌组分中R100、R80、R50组分与混合组分中H50、H30、HH洗脱组分有保护过氧化氢损伤人脐静脉血管内皮细胞的作用(P0.05),多糖组分无作用。结论二萜醌中极性小的成分与混合组分中极性大的成分是保护血管内皮细胞损伤方面的药效物质活性组分。     

卵泡抑素样蛋白1促进肺动脉内皮细胞增生、黏附与血管生成

目的 探究卵泡抑素样蛋白1（follistatin-like 1,FSTL1）对人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs）的影响,完善FSTL1在肺动脉高压（pulmonary hypertension,PH）中的作用。方法 以人肺动脉内皮细胞为对象,使用qRT-PCR和Western blotting法测定低氧刺激下HPAECs中FSTL1的表达水平。通过给予外源性FSTL1蛋白或小干扰RNA,MTT法观察FSTL1对细胞增生活性的影响。分别借助纤连蛋白、Matrigel基质胶观察FSTL1对内皮细胞黏附与血管形成能力的影响。结果 低氧刺激HPAECs 12 h和24 h后,FSTL1的mRNA及蛋白质的表达量均提高（P<0.01）。常氧下外源给予FSTL1,250 μg/L、500 μg/L组的细胞增生活性与对照组相比明显增高（P<0.01）;低氧条件下siRNA干扰组HPAECs增生活性与对照组相比明显降低（P<0.001）。常氧下外源给予250 μg/L的FSTL1刺激24 h后HPAECs黏附数量增多（P<0.001）,生成血管总长度及新生血管数目均增加（P<0.001）。结论 FSTL1促进HPAECs增生、黏附与血管生成。     

广东产眼镜蛇毒及其组份C对小鼠的抑瘤作用研究

本文进行了体内和体外实验，体内实验通过腹腔注射及灌胃给药，发现广东产眼镜蛇毒及其组份C对小鼠实验性肝癌及S-180肉瘤均有明显抑瘤作用，但口服给药剂量须达到腹腔注射给药剂量的50倍，才能产生相似的药效;体外实验中原毒及其组份C的抑癌作用量效关系明显，剂量增大肿瘤生长缓慢甚至完全不生长;在一定剂量范围内，组份C的抑瘤作用较原毒强。结果表明，广东产眼镜蛇毒及其组份C有抗实验性肝癌及S-180的作用。     

眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核c-jun表达的影响

目的:探讨眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核(VM)c-jun表达的影响。方法:将18只SD大鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、眼镜蛇毒组,每组6只。采用免疫组织化学方法观察VM的c-jun表达。结果:与正常对照组和生理盐水组相比,眼镜蛇毒组大鼠VM的c-jun表达增加(P<0.01)。结论:眼镜蛇毒对大鼠VM的c-jun表达有上调作用。     

眼镜蛇毒组份M对血液流变学的影响

静脉注射眼镜蛇毒M组份（0．07mg／kg和0．1mg／kg）可使家兔和狗的全血粘度和血浆粘度降低，对家兔红细胞压积和红细胞电泳时间无影响。M组份在体内外均能抑制ADP和花生四烯酸所诱导的血小板聚集。     

眼镜蛇毒M组份对血小板聚集功能的研究

本文用眼镜蛇毒提取的 M 组份,对58例健康人的血小板聚集功能进行研究,发现其能抑制血小板对 ADP 的诱聚,初步认为其作用与其所含之纤溶酶与磷脂酶 A_2有关。     

中华眼镜蛇毒组份M抑制血小板聚集作用机制初探

探讨中华眼镜蛇毒组份Ｍ抑制血小板聚集作用机制;方法：运用卵磷脂法、剩余可凝纤维蛋白原法、纤维蛋白平板法等分别测定了中华眼镜蛇毒组份Ｍ中磷脂酶Ａ_２（ＰＬＡ_２）,纤维蛋白原溶解酶及纤维蛋白溶解等与血小板聚集相关的酶活性,并运用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析了组份Ｍ对血小板内细胞骨架蛋白的影响;结果：组份 Ｍ不含 ＰＬＡ_２活性,无纤维蛋白（原）溶解酶活性,亦无ＡＤＰ酶和 ５’－核苷酸酶活性,不影响正常人血浆乳酸脱氢酶的含量,但对ＡＤＰ诱导的血小板细胞内肌动蛋白微丝聚合物的形成有明显抑制作用;结论：中华眼镜蛇毒组份Ｍ对血小板聚集所依赖的血小板内细胞骨架系统的功能有抑制作用。     

中华眼镜蛇毒四个组份对呼吸窘迫综合征影响的实验研究

用DEAE Sephadex A50层析柱把眼镜蛇毒分离得4个组份,分别试用于动物的油酸型RDS模型。结果显示:与对照组相比,组份4使实验组小白鼠的肺系数降低且呈量—效关系;使实验组家兔PaO_2下降幅度减少;支气管—肺泡灌洗液蛋白渗出量减少:组份4还显示具有抗补体活性的作用,其缓解油酸型RDS的作用可能与此有关。     

眼镜蛇毒M组分对冠心病血液流变学的影响

观察了20例冠心病的血液流变学的改变,均显示其不同程度的血液高粘滞度。其中10例使用了眼镜蛇毒M组分治疗。与对照组(10例)相比较,治疗组的血液高粘滞度得到缓解。并对眼镜蛇毒M组分的去纤、溶栓以及抑制血小板聚集功能的作用加以讨论。     

分泌型磷脂酶 A2非酶活性依赖的神经元保护作用

【目的】鉴定中华眼镜蛇(Najanajaatra)蛇毒中的神经保护因子,研究其抗神经元凋亡作用机制。【方法】连续柱层析法分离、纯化蛇毒神经保护因子。用EdmanN-末端测序法取得蛋白质一级序列,BLAST软件进行蛋白质鉴定。使用低钾诱导体外培养小脑颗粒神经元凋亡模型,研究其神经元保护作用。【结果】从中华眼镜蛇蛇毒中分离出一种,可浓度依赖性地抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。神经保护因子(Cobravenomneu-ronalprotectivefactor,CVNPF)此神经保护因子N-末端20个氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSRSWWD-,BLAST序列同源比对确定该保护因子为中华眼镜蛇分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2,sPLA2)。进一步发现来源于蜂毒、莫桑比克眼镜蛇(Njajanajamossambica)蛇毒、西部菱斑响尾蛇(Crotalusatroxalso)蛇毒的sPLA2也对小脑颗粒神经元具有保护作用;其作用不为磷脂酶A2酶活性抑制剂7,7-Dimethyleicosadienoicacid(DEDA)和Manoalide阻断。【结论】CVNPF属于sPLA2。多种sPLA2可以抗神经元凋亡,其保护机制与磷脂酶A2的酶活性无关。     

眼镜蛇毒对成年大鼠脊神经节BDNF和c-jun表达的影响

目的:探讨眼镜蛇毒对成年大鼠脊神经节脑源性神经营养因子(BDNF)和c-jun表达的影响。方法:大鼠24只随机分为正常对照组、生理盐水组和眼镜蛇毒组,每组8只。用免疫组织化学的方法,观察在各组大鼠脊神经节BDNF和c-jun的表达。结果:大鼠脊神经节BDNF和c-jun眼镜蛇毒组细胞平均灰度值低于正常对照组和生理盐水组(P<0.01),且阳性神经元眼镜蛇毒组多于正常对照组和生理盐水组(P<0.01)。结论:眼镜蛇毒能上调脊神经节BDNF和c-jun的表达,这种表达增加可能与脊神经节损伤的代偿性修复有关。