重组腺病毒IL-2诱导HeLa 细胞凋亡水平的测定

目的建立IL-2基因表达和诱导HeLa细胞凋亡水平的测定方法.方法用重组腺病毒IL-2感染HeLa细胞,无需DNA提取,毛细管电泳直接检测凋亡细胞;表达的IL-2用ELISA和MTT检测.结果用毛细管电泳能检测出HeLa细胞凋亡峰,与环磷酰胺对照一致;IL-2表达量为25 ng,表达活性为700 IU*ml-1.结论方法选择性高、重复性好,应用简便.     

重组人p53腺病毒联合紫杉醇对胃癌细胞的作用

目的 研究重组人p53腺病毒增加胃癌细胞对紫杉醇敏感性的作用.方法 重组人p53腺病毒感染胃癌细胞BGC-823,Western blot法检测p53蛋白在胃癌细胞中的表达;MTT法测定重组人p53腺病毒单独及联合紫杉醇用药的不同浓度处理细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡.结果 重组人p53腺病毒感染BGC-82348h,p53蛋白在BGC-823中高表达,并产生G2/M期阻滞和细胞凋亡.重组人p53腺病毒联合紫杉醇用药增加紫杉醇的敏感性,有剂量时间的依赖性.结论 腺病毒介导p53基因感染BGC-823细胞诱导凋亡并增加胃癌细胞对紫杉醇的敏感性.本实验为p53基因治疗与胃癌化疗临床结合提供了可靠的实验依据.     

重组人p53腺病毒对肝癌细胞作用的病理学观察

目的观察重组人p53腺病毒注射液（rAd—p53）瘤内注射对肝癌细胞的作用。方法20例兔肝细胞癌动物模型,分为2组,每组10例,A组瘤内注射rAd—p53,B组瘤内注射生理盐水。治疗后取肿瘤组织进行病理学观察及凋亡检测（TUNEL法）。结果A组凋亡指数（AI）为6．44±1．91,B组为2．46±1．21,2组之间统计学有显著性差异。结论rAd—p53对肝细胞癌有明显的抑制作用。     

重组腺病毒人白细胞介素2的质量分析

目的通过对重组腺病毒人白细胞介素2(Adv-IL2)的质量研究和实验方法参数的选择,建立Adv-IL2的质量控制标准。方法选用CPE法测定病毒滴度;将病毒转染Hela细胞,表达出IL-2,分别用MTT法和ELISA法测定IL-2的活性和表达量。建立了UV和IE-HPLC系统分析纯度;琼脂糖凝胶电泳检查基因组分子量和基因组酶切图谱;PCR法鉴定病毒特征基因E2B区、IL-2表达基因盒和外源因子(复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV);按照《中国生物制品规程》的有关规定进行了其他项目检查。结果测定的重组腺病毒人白细胞介素2原液滴度达3×10¹⁰ pfu·mL^-1。IL-2表达活性达700 U·mL^-1,表达量约25 ng·mL^-1。制品的A_{260 nm}/A_{280 nm}为1.23;IE-HPLC纯度检查大于98%。基因组分子量和基因组酶切图谱以及病毒特征基因E2B区和IL-2表达基因检查结果均在理论值范围;复制型病毒RCV,HIV,HBV和HCV检测均呈阴性;其他项目均符合规定。结论建立了重组腺病毒人白细胞介素2的质量标准,并可有效地控制制品的质量。     

重组腺病毒介导的前列腺癌基因治疗研究进展

前列腺癌的基因治疗已逐渐成为研究热点。载体系统是基因治疗的基础。目前,腺病毒载体在前列腺癌基因治疗中应用最为广泛。溶瘤腺病毒的研究进展为前列腺癌基因治疗开辟了新的途径。近年研究表明,溶瘤腺病毒单独使用或与治疗基因联合应用,能够有效发挥抗肿瘤效应。治疗基因是发挥功能的关键因素。自杀基因能将药物转化为毒性代谢产物,细胞因子能增强抗肿瘤免疫效应,血管生成抑制因子能抑制血管生成,凋亡相关分子能诱导细胞凋亡,这些基因在前列腺癌的基础和临床研究中均表现出一定的肿瘤生长抑制作用。本文对重组腺病毒介导的前列腺癌基因治疗基础及临床研究进展进行综述。     

人甲胎蛋白启动子控制HIV-1 Vpr表达的重组腺病毒体内抑瘤效果研究

目的：研究人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒对裸鼠肝癌模型的肿瘤组织生长抑制作用,探讨其应用于肝癌基因治疗的可行性。方法：将人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒（rvAdAFP-Vpr）直接注射到利用BEL-7402细胞建立的肝癌裸鼠模型瘤体内,同时往裸鼠腹腔内注射环磷酰胺（CTX）,经过1个月的治疗,利用肿瘤生长曲线、增殖指数、凋亡指数等指标,观察rvAdAFP-Vpr对肝癌组织生长抑制的效果。结果：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒在肝癌组织中表达了Vpr蛋白,rvAdAFP-Vpr注射明显诱导肿瘤细胞凋亡,抑制了体内肝癌组织的生长,rvAdAFP-Vpr治疗组和rvAdAFP-Vpr＋CTX治疗组抑瘤率分别达到41％和66．7％,与空白对照组和rvAd-null组相比,具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）,两组的Ki-67指数和凋亡指数相比,对照组和空腺病毒载体（rvAd-null）组同样具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）。结论：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒rvAdAFP-Vpr通过引起肝癌细胞凋亡,有效抑制了体内肝癌组织的生长。本研究结果为HIV-1 Vpr应用于肝癌治疗提供了依据。     

人ASPP2重组腺病毒质量控制研究

目的对人ASPP2重组腺病毒制剂进行质量分析,并针对其关键质量特性建立质控方法。方法采用PCR法对重组腺病毒的载体结构特征基因E2B和目的基因ASPP2进行扩增,琼脂糖电泳进行分子量鉴定;采用UV-SDS法测定重组腺病毒的病毒颗粒数;采用组织培养半数感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒的感染滴度;采用Western blot法对重组腺病毒感染靶细胞后目的蛋白ASPP2的表达情况进行检测;通过MTT实验观察重组腺病毒对肝癌细胞的生物学效应;采用A549细胞进行重组腺病毒的复制型病毒检测。结果腺病毒载体E2B基因和目的基因ASPP2的鉴定结果与理论值相符;重组腺病毒的病毒颗粒数为每毫升5.6×10~(12)VP,病毒滴度为每毫升2×10~(11)IU,比活性为3.5%;病毒感染靶细胞24 h后可检测出ASPP2蛋白的表达;重组腺病毒对肝癌细胞具有生长抑制作用;复制型腺病毒(RCA)水平小于1 RCA/3.0×10~(10)VP,符合中国食品药品监督管理局(SFDA)的标准。结论建立了人ASPP2重组腺病毒的关键特征的质量控制方法,为该重组腺病毒质量标准的建立及相关应用奠定了基础。     

EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果及分布研究

背景与目的 EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2是预防和治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原,本研究以食蟹猴为研究系统,观察携带EBV潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)在动物体内引起的细胞免疫应答及病毒载体分布。方法分别使用低、中、高不同剂量的Ad-LMP2,于0周、4周以肌内多点注射的方式免疫食蟹猴,应用流式细胞仪检测动物外周血CD3、CD4、CD8阳性T细胞的比值;γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γ-ELISPOT法)检测Ad-LMP2诱导的LMP2特异性CTL;RT-PCR方法检测首次和末次注射后,不同时间点外周血中重组病毒的载量,以及8周后,脑、心、肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢和注射局部肌肉的基因分布情况。结果与同期对照组或免疫前比较,Ad-LMP2免疫的动物外周血T淋巴细胞亚群未见差异(P>0.05);低、中、高不同剂量都能够诱导产生LMP2特异性CTL,其中,中、高剂量组反应水平较高;Ad-LMP2肌内注射后15min～1h在血中浓度最高,2～8h后分布到其他脏器。1d后,病毒主要分布在注射局部的肌肉组织中,而在脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢或睾丸等组织内,未检测到重组病毒。结论 Ad-LMP2在食蟹猴体内能够诱导产生LMP2特异性CTL,对T淋巴细胞亚群不产生影响,重组病毒只分布在注射局部肌肉,没有潜在危险。     

不同时间EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果研究

目的观察携带EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)免疫Balb/C小鼠后,不同时间点的免疫反应。方法每只小鼠通过肌内注射的方式免疫2×109VP的Ad-LMP2重组病毒颗粒,使用γ干扰素酶联免疫斑点检测方法(IFN-γELISPOT),分别于免疫后1、2、3、4、5周检测小鼠脾淋巴细胞中,LMP2特异性释放IFN-γ的细胞数。观察不同时间点特异性CTL反应强度的变化。结果 Ad-LMP2免疫小鼠1周时,就已经产生明显针对LMP2的特异性CTL,1×106个小鼠脾淋巴细胞中,可以检测到约800个特异性释放IFN-γ的细胞。随着时间的延长,与1周时的结果相比CTL水平2、3、4周均没有明显改变,5周时稍有下降(P<0.05)。结论 Ad-LMP2免疫Balb/C小鼠,1周内就能够诱导出LMP2特异性CTL,产生的CTL能够稳定存在。     

人肝癌细胞体外氨基酸代谢

目的：研究肝癌细胞对氨基酸的代谢作用。方法：对人肝癌细胞系（SMMC－7721）体外培养，观察培养液氨基酸成分的动态变化，同时对人正常肝细胞做对比研究，结果：肝癌细胞体外培养24h，培养液中精氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺（P＜0．01），牛磺酸（P＜0．05）的含量明显下降，培养48h，除上述4种氨基酸外，培养液中精到,苏氨酸，谷氨酰胺（P＜0．01），牛磺酸（P＜0．05）的含量明显下降，培养48h，除上述4种氨基酸外，培养液中丝氨酸，半胱氨酸的含量也明显下降（P＜0．05），人正常肝细胞培养24h，培养液中谷氨酰胺，精氨酸（P＜0．01），半胱氨酸（P＜0．05）含量明显下降，培养48h，培养液中谷氨酰胺，半胱氨酸，精氨酸，组氨酸（P＜0．01），丝氨酸（P＜0．05）含量明显下降，结论：肝癌细胞体外增殖过程对精到，谷氨酰胺，苏氨酸，牛磺酸的消耗明显增加，此外，对丝氨酸，半胱氨酸也有一定的消耗，这6种氨基酸可能为肝癌代谢所必需，其中牛磺酸与苏氨酸是肝癌细胞所需氨基酸中有别于正常肝细胞的部分。     

PCR定量分析ERCC2基因在人肿瘤细胞中的表达

核苷酸切除修复交叉互补（ERCC2）基因是核苷酸切除修复（NER）系统中的重要成员，被认为可能与某些肿瘤的发生和肿瘤耐药有关。由于ERCC2基因在肿瘤标本中的表达甚低，定量分析困难，故改良逆转录-聚合酶链式反应（RT－PCR），建立双管ERCC2表达的定量方法。对16株人肿瘤细胞进行定量分析，三批实验间的误差甚小。本定量方法可靠、准确，能对0．25pgDNA基因表达定量，适用于对ERCC2基因表达的生物-生理学作用作深入研究，也可被用于对其它低表达基因的定量分析。     

肿瘤抑制基因p53表达与人脑肿瘤对氯乙基亚硝脲耐药

目的：探讨人脑肿瘤p53表达与对亚硝脲类抗癌药耐药的关系。方法：采用WesternBlot分析,对10株人脑肿瘤细胞的p53、ERCC2表达进行检测,并与肿瘤对二氯乙基亚硝脲（BCNU）及二氯乙基肉芥子亚硝脲（SarCNU）耐药性进行比较。结果：ERCC2表达与肿瘤对BCNU和SarCNU耐药相关。p53与BCNU和SarCNU耐药相关。多元回归分析,ERCC2＋p53与BCNU和SarCNU间的相关性明显提高。结论：ERCC2和p53基因表达在人脑肿瘤对亚硝脲类抗癌药耐药中起重要作用。     

小细胞肺癌细胞系H446肿瘤细胞球培养方法的优化

目的:探讨优化体外培养小细胞肺癌细胞株H446肿瘤细胞球的方法。方法:利用干细胞无血清培养技术,观察H446细胞在下述不同培养条件下肿瘤细胞球的生长情况,并接种于超低吸附及非超低吸附培养板,调整细胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL,采用针头吹打法和移液器吹打法将肿瘤细胞球制成单细胞悬液用以进一步传代。结果:(1)超低吸附培养板第2天形成明显肿瘤细胞球,非超低吸附培养板第10天出现肿瘤细胞球。(2)1×106/mL组每个高倍视野下约有7个肿瘤细胞球,每个细胞球约由几十个甚至上百个细胞组成。(3)针头吹打法传代后肿瘤细胞球活性和增殖能力明显优于移液器吹打法。结论:选择超低吸附培养板、1×106/mL密度接种和针头吹打法可有效分离肿瘤细胞球。     

UCN-01 Enhances the In Vitro Toxicity of Clinical Agents in Human Tumor Cell Lines

UCN-01 is undergoing Phase I evaluation and is a candidate forcombination strategies in the clinic. UCN-01 has been shown to havea variety of effects on cellular targets and the cell cycle. It hasalso been reported to sensitize cells to several clinical drugsin vitro, possibly in a manner related to p53 status. Thus,combinations of UCN-01 with a series of clinical agents in varietyof cell lines have been investigated in vitro. Certain celllines demonstrated synergistic interactions with combinations ofUCN-01 (20–150 nM) and thiotepa, mitomycin C, cisplatin, melphalan,topotecan, gemcitabine, fludarabine or 5-fluorouracil. In contrast,UCN-01 combinations with the antimitotic agents, paclitaxel andvincristine, or topoisomerase II inhibitors, adriamycin andetoposide, did not result in synergy, only in additive toxicity.Cells with non-functional p53 were significantly more susceptibleto the supra-additive effects of certain DNA-damaging agents andUCN-01 combinations, than cells expressing functional p53 activity.In contrast, there was no significant relationship between p53status and susceptibility to synergy between antimetabolites andUCN-01. The mechanism behind the observed synergy appearedunrelated to effects on protein kinase C or abrogation of the cellcycle in G2. Moreover, increased apoptosis did not fully explainthe supradditive response. These data indicate that UCN-01sensitizes a variety of cell lines to certain DNA-damaging agents(frequently covalent DNA-binding drugs) and antimetabolites invitro, but the mechanism underlying this interaction remainsundefined.     

肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测

目的:分离提纯和电镜鉴定乳腺癌细胞系MCF-7细胞分泌的胞外体,并观察其对淋巴细胞增殖的影响.方法: 将细胞培养上清进行分步离心、浓缩、密度梯度离心获得纯化后的胞外体,并对胞外体进行透射电镜鉴定.将分离纯化的胞外体加入含有IL-2的淋巴细胞培养体系中,用MTT试验计算淋巴细胞的增殖率,观察胞外体对淋巴细胞增殖的影响.结果:从2×10~7个细胞可获得20 mL纯化的胞外体,测得其总蛋白浓度为(1.84±0.01) g/L,经电镜鉴定MCF-7细胞来源的胞外体直径为55～70 nm,为有膜包裹的囊泡状结构,大小较为均一,形态特征与观察到的多泡体的内部囊泡的大小和形态是一致的.MTT试验显示它能够抑制IL-2诱导的淋巴细胞增殖,并且随剂量增加抑制作用增强.结论:肿瘤细胞来源的胞外体可通过细胞培养上清分步离心浓缩纯化得到,其不仅具有胞外体的形态学特征,同时可对IL-2诱导的淋巴细胞增殖产生剂量依赖性的抑制作用.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌HT-29细胞MMP-9表达的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人结肠癌细胞株HT-29基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响.方法:应用RT-PCR法和Western blot法检测EGCG干预前后HT-29结肠癌细胞中MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白表达.结果:EGCG 25、50、100 mg/L作用于结肠癌细胞株HT-29 48 h后,与对照组比较,MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白的表达量随着EGCG浓度的增加而下降,且各浓度组间差异也有统计学意义(P<0.05).结论:EGCG可显著抑制HT-29细胞中MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白的表达,呈剂量依赖性,可能是其抗癌机制之一.     

白藜芦醇对肝癌Bel-7404细胞体外放射治疗的影响

目的：探讨白藜芦醇（ Res）联合体外放射治疗（放疗）对肝癌Bel-7404细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。方法25μmol·L-1 Res联合放疗处理肝癌Bel-7404细胞,并将细胞分为4组：对照组,2 Gy放疗组,4 Gy放疗组,6 Gy放疗组,噻唑蓝（ MTT）法检测肿瘤细胞的增殖及运动侵袭能力,荧光显微镜检测细胞凋亡,Western-blot法检测细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达情况。结果与对照组比较,2 Gy放疗组、4 Gy放疗组、6 Gy放疗组肝癌Bel-7404细胞增殖能力及侵袭能力均下降,凋亡细胞增多（ P〈0.05）。结论 Res能增强肝癌Bel-7404细胞对放疗的敏感性,放疗联合Res可使肝癌细胞增殖受抑,侵袭减弱,凋亡增加,其原因与降低MMP-2、VEGF蛋白表达有关。     

槲皮素对肝癌HepG2细胞生长影响的体外研究

目的 观察槲皮素对肝癌HepG2细胞生长及hTERT基因表达的影响.方法 以台盼蓝拒染法计数肝癌细胞的生长抑制率,用透射电镜从形态变化方面了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,Western-blot检测hTERT基因表达改变,PCR-TRAP法检测端粒酶活性.结果 槲皮素抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的半数抑药浓度（IC5o）为25.5μmol/L;形态学检测显示出了细胞凋亡的特征变化,经10-20 μm/L的槲皮素处理,肝癌HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,且HepG2细胞hTERT蛋白降低,端粒酶活性被抑制.结论 槲皮素能呈时间、剂量依赖性地抑制肝癌细胞的生长,能诱导HepG2细胞发生凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT基因表达、抑制端粒酶活性、破坏端粒稳定性有关.